[发明专利]一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶酶E4及其应用

说明书

本发明公开了一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。本发明所述的一种定点突变改造的纤维素酶E4是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于褐色热单胞杆菌(Thermonospora fusca)的纤维素酶E4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。本发明所述的纤维素酶E4不仅依然对纤维素具有催化功能，而且提高了其对胃蛋白酶的耐受性。

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶胃蛋白酶E4，特别是一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。

背景技术

纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据各酶功能的不同主要分为三类：(1)葡聚糖内切酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase，EC.3.2.1.4)，来自于真菌简称为EG；来自于细菌简称成为Len，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；(2)葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucancellobihydrolase，EC.3.2.1.91)，来自于真菌简称为Cbh；来自于细菌简称成为Cex，这类酶作用于纤维素线性分子末端，水解β-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶 (cellobiohydrolase)；(3)β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，E.C3.2.1.21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

作为纤维素酶的重要组成部分纤维素酶E4，它是由褐色热单胞菌(Thermomonospora fusca)产生的，T.fusca是一种生存在土壤中的嗜热的丝状放线菌，其产生6种结构和功能各有特点的纤维素酶。包括：两种外切纤维素酶，三种内切纤维素酶，褐色热单胞菌产生的另外一种，也是最为独特的一种纤维素酶为Cel9A(ex-E4)，它同时表现出内切酶和外切酶的共同的活性，具有较高的研究利用价值，因此也是饲用酶制剂中纤维素用酶的首选。

我国配合饲料中除一般玉米-豆粕型日粮，还有在玉米-豆粕型日粮基础上加入10％-40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲料原料，这使得饲料中非淀粉多糖(NSP)和植酸等抗营养因子增多降低了畜禽对饲粮中营养物质的消化、吸收及利用，影响畜禽健康和生产性能。因此饲用酶制剂在饲料工业中占有重要地位。另外，外国低价格小麦、大麦产品的涌入，将进一步刺激饲用酶制剂的市场需求。目前，饲用酶制剂在世界各国广泛应用于猪、家禽、反刍动物、水产动物的饲粮中。随着生物技术的发展，通过微生物发酵方法可大量人工制成各种酶制剂，为其在饲料工业中大规模应用提供了保障。

麦类日粮中各种植物性饲料原料都由无数植物细胞构成，细胞的细胞壁包裹着淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质。细胞壁主要由纤维素，半纤维素、果胶和木质素等构成，饲料粉碎工序难以破坏细胞壁。单胃动物消化酶液无法消化细胞壁物质，而NSP酶降解细胞壁中的细胞壁物质，使细胞壁崩解，释放出被细胞壁包裹的养分，为动物所利用。作为NSP酶中重要组成部分纤维素酶发挥着重要作用。

饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，它本身作为一种具有生物活性的蛋白，其发挥作用受到动物消化道环境的影响，而胃中较低的pH值可能对酶的活性有很大影响，降低了酶制剂的使用效率。因此获得具有蛋白酶抗性的酶制剂很有必要。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。

本发明是对纤维素酶E4的基因进行定点突变。由褐色热单胞杆菌(Thermonospora fusca)中获得得纤维素酶E4已经被测序。GenBank登录号为 L20093.1，长度为2502bp，编码834个氨基酸残基。