[发明专利]一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于超氧化物歧化酶制备技术领域，具体涉及一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制 备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金 属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基。SOD在防辐射、 抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、 化妆品等领域得到越来越多的应用。

到目前为止，已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物 等生物体内分离得到SOD。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类： 铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在 于原核细胞和少数植物细胞中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞 的细胞质中。因此，最适合人体使用的SOD为Cu/Zn-SOD。

国内Cu/Zn-SOD的研究主要侧重于动植物的提取和纯化。其中动物来源的，由于存在 原材料有限及卫生安全性等问题，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险大；而植 物来源的与人自身的有一定差异，存在免疫原性等问题。因此，利用基因工程生产人源铜 锌超氧化物歧化酶是解决原料来源、获得无免疫原性、高活性Cu/Zn-SOD的有效途径。目 前已有通过基因工程技术生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)的先例，但仍存在许多 问题，主要包括：(1)目的蛋白表达量不高，由于异源表达系统影响目的蛋白表达量；(2) 纯化过程复杂，不带纯化标签的需要经过离子交换、分子排阻和/或等一系列的层析手段进 行纯化，而带纯化标签的以包涵体形式存在，又需要经过变性、复性等繁琐的工艺获得活 性形式。

发明内容

本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种人源铜锌超氧化物歧化酶的 制备方法，提高目的蛋白的表达量，提高酶的比活力，简化制备过程。

本发明的技术方案如下：

一种用于构建人源铜锌超氧化物歧化酶重组载体的核苷酸序列，该序列包括在人源铜 锌超氧化物歧化酶N末端添加的His-TEV标签，该序列如SEQ ID NO.2所示。

一种人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的序列插入原始载体， 构建重组载体，扩大培养后提取表达产物，N-His-TEV-hSOD1酶解，纯化得到无标签的 hSOD1。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，所述原始载体可以为真核表 达载体或原核表达载体。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，所述原始载体可以为pET28a。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，N-His-TEV-hSOD1酶解采用 TEV蛋白酶。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)将SEQ ID NO.2的序列以人工合成的方式插入原始载体中，以构建重组载体；

(2)将重组载体导入表达菌株，得到重组菌株；

(3)将重组菌株扩大培养；

(4)将菌体破碎，离心得到上清液；

(5)将上清液纯化，得到纯化后带标签的N-His-TEV-hSOD1；

(6)将N-His-TEV-hSOD1酶解，得到切除标签的酶液；

(7)将切除标签的酶液纯化，得到纯化后的无标签的hSOD1。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，步骤(2)中表达菌株为大肠 杆菌，优选大肠杆菌Codonplus。

进一步地，所述的人源铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，步骤(3)中重组菌株扩大培 养过程为将重组菌株在25～37℃、含10～50μg/mL卡那霉素和10～50μg/mL氯霉素的LB 培养基中培养至OD₆₀₀达0.4～1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，在15～42℃下诱导 4～16小时，离心收集菌体；更进一步地，培养至OD₆₀₀达0.4～1.0，加入终浓度为0.1-1.0mM 的IPTG，同时分别加入500μM以内的Cu²⁺和Zn²⁺，诱导温度为15～42℃，诱导时间为4～16 小时。