[发明专利]一种用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体、重组菌株及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于超氧化物歧化酶制备技术领域，具体涉及一种用于表达人源铜锌超氧化物歧 化酶的重组载体、重组菌株及制备方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金 属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基。SOD在防辐射、 抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、 化妆品等领域得到越来越多的应用。

到目前为止，已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物 等生物体内分离得到SOD。根据其活性中心结合的金属离子的不同，SOD主要分为三类： 铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)。其中，Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，Mn-SOD主要存在 于原核细胞和少数植物细胞中，而Cu/Zn-SOD则主要存在于包括人类在内的真核生物细胞 的细胞质中。因此，最适合人体使用的SOD为Cu/Zn-SOD。

国内Cu/Zn-SOD的研究主要侧重于动植物的提取和纯化。其中动物来源的，由于存在 原材料有限及卫生安全性等问题，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险大；而植 物来源的与人自身的有一定差异，存在免疫原性等问题。因此，利用基因工程生产人源铜 锌超氧化物歧化酶是解决原料来源、获得无免疫原性、高活性Cu/Zn-SOD的有效途径。目 前已有通过基因工程技术生产人源铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)的先例，但仍存在许多 问题，主要包括：(1)目的蛋白表达量不高，由于异源表达系统影响目的蛋白表达量；(2) 纯化过程复杂，不带纯化标签的需要经过离子交换、分子排阻和/或等一系列的层析手段进 行纯化，而带纯化标签的以包涵体形式存在，又需要经过变性、复性等繁琐的工艺获得活 性形式。

发明内容

本发明的目的在于为了解决以上现有技术的不足而提供一种用于表达人源铜锌超氧化物 歧化酶的重组载体、重组菌株及制备方法，将该重组菌株应用与制备人源铜锌超氧化物歧化 酶，可以提高目的蛋白的表达量，提高酶的比活力，简化制备过程。

本发明的技术方案如下：

一种用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，通过将SEQ ID NO.2所示的序列 插入原始载体，构建而成，其中SEQ ID NO.2所示序列为在人源铜锌超氧化物歧化酶N末 端添加了His-TEV标签。

所述的用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体，原始载体为真核表达载体或原 核表达载体，优选原始载体为pET28a。

所述的用于表达人源铜锌超氧化物歧化酶的重组载体的构建方法，将SEQ ID NO.2的 序列以人工合成的方式插入原始载体中，构建重组载体；具体为将pET28a固定在载体上， 经过脱保护、偶联、加帽、氧化等一系列化学合成过程直接把目的基因按序列顺序一个一 个地连接在原始载体的多克隆位点处，构建重组载体。

一种重组菌株，通过以上所述的重组载体导入表达菌株得到。

所述的重组菌株，表达菌株为大肠杆菌，优选大肠杆菌Codonplus。

所述的重组菌株的制备方法，首先制备大肠杆菌感受态细胞，然后将重组载体转化大 肠杆菌感受态细胞得到重组菌株。

所述的重组菌株的制备方法，制备大肠杆菌感受态细胞为通过CaCl₂化学法制备。