[发明专利]糖类抗原CA19‑9测定试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，主要涉及测定血液中糖类抗原19-9含量的试剂盒的制备及其检测方法。

背景技术

CA199是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，在血清中以唾液粘蛋白形式存在，分子量为300～500万。胎儿的胃、肠、肝和胰脏中均有CA199表达，正常成人则仅在胰脏、肝脏、胆囊和肺有极少量的表达。有研究表明，胆管癌患者血清CA199升高的敏感性、特异性分别为88.15％、92％(<37U/mL)，因此检测血清中CA199对胆管癌患者的诊断有较高价值。此外，CA199对胃癌、卵巢恶性肿瘤的鉴别有一定的价值。

医院临床检测血清CA19-9含量的方法有：放射免疫法、酶联免疫法及化学发光免疫检测法。放射免疫法自于上世纪60年代以来，在生物医学领域得到了广泛应用，但是该检测方法由于存在放射线辐射和污染等问题已逐渐被市场淘汰。1971年，Engvall和Vanweemen各自领导的研究小组分别以酶代替同位素，创立了酶免疫分析技术(EIA)。因其标记物制备简单，有效期长，对环境无污染等特点，EIA技术得到了迅速的普及和发展。但是该方法操作过程繁琐，灵敏度及特异性还有待于进一步提高。化学发光免疫检测方法是继放射免疫法与酶联免疫法之后发展起来的新兴技术，它是将具有高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性的免疫反应相结合的一种检测技术，由于其具有灵敏度高、特异性高、方法简便、效期长、无放射性同位素污染，且全自动检测仪器研制发展较快，使得这一检测技术得到了广泛关注与应用。

目前我国已批准上市的糖类抗原199(CA199)免疫检测试剂有进口和国产两大类，进口试剂有贝克曼、雅培、西门子、罗氏等跨国定量检测公司的产品，采用的方法学多为化学发光，其中罗氏产品为电化学发光法；国内已经多家产品获得批准上市，如北京利德曼生化股份有限公司、上海科华生物工程股份有限公司、北京科美生物技术有限公司。但是目前国内CA19-9临床检测主要以进口试剂为主，而国外进口试剂价格昂贵，不利于推广使用，因此开发一种灵敏度高、准确度高的CA19-9测定试剂盒是至关重要的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种糖类抗原CA19-9定量测定试剂盒，通过优化标记吖啶酯及包被磁珠的实验条件与技术，提高CA19-9检测的灵敏度、特异性，并降低检测成本，延长有效期。

本发明为解决上述技术问题提供的方案是：制备一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒，该试剂盒包括的主要成分有以下下四个部分：磁分离试剂R1、标记试剂R2、CA19-9校准品、CA19-9质控品。

所述的磁分离试剂R1是含有CA19-9单克隆抗体包被的羧基磁珠；

所述的标记试剂R2是含有标记有吖啶酯的CA19-9单克隆抗体；

所述的CA19-9校准品、质控品是含有一定量CA19-9抗原的BSA溶液。

本发明试剂盒中四种组分的制备方法如下：

一.磁分离试剂R1的制备过程

(一).磁珠缓冲液配置过程，配置1L：

(1).称量纯化水800g，三羟甲基氨基甲烷7.27g，PROCLIN3000.6g，甲基纤维素醚4.38g于烧杯中，搅拌溶解2h，调节pH至8.0±0.05。

(2).称量吐温-203.15g，硫酸新霉素1.12g，四环素35mg，牛血清白蛋白5.18g于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至8.0±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定容至1L，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).偶联封闭液的配制

(1).称量纯化水50g，HEPES 0.60g，NaCl 0.9g，鱼皮明胶0.2g，PVP3600.2g，葡聚糖2000000.3g，

普兰多糖0.15g，蔗糖0.2g，BSA0.2g，于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).取吐温-2050μL，PROCLIN300100μL于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至7.5±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至100g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤即可。

(三).CA19-9单克隆抗体偶联羧基磁珠制备步骤：

(1).取250μL磁珠，弃去上清，用MES缓冲液(100mM MES，pH5.0)500μL洗涤两次；加入1250μL缓冲液，充分混匀；超声分散20s，40％(4次×5s/次)。