[发明专利]糖类抗原CA19‑9测定试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括磁分离试剂R1、标记试剂R2、CA19-9校准品、CA19-9质控品。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁分离试剂R1是含有CA19-9单克隆抗体包被的羧基磁珠；

所述的标记试剂R2是含有标记有吖啶酯的CA19-9单克隆抗体；

所述的CA19-9校准品、质控品是含有一定量CA19-9抗原的BSA溶液。

3.如权利要求1～2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒各组分的制备方法如下：

一.磁分离试剂R1的制备过程

(一).磁珠缓冲液配制过程，配制1L：

(1).称量纯化水800g，三羟甲基氨基甲烷7.27g，PROCLIN300 0.6g，甲基纤维素醚4.38g于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).称量吐温-20 3.15g，硫酸新霉素1.12g，四环素35mg，牛血清白蛋白5.18g于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至8.0±0.05

(3).将步骤(2)所得溶液定量至1000g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).偶联封闭液的配制，配制100mL：

(1).称量纯化水50g，HEPES 0.60g，NaCl 0.9g，鱼皮明胶0.2g，PVP360 0.2g，葡聚糖200000 0.3g，普兰多糖0.15g，蔗糖0.2g，BSA 0.2g，于烧杯中，搅拌溶解2h。

(2).取吐温-20 50μL，PROCLIN300 100μL于步骤(1)所得溶液中，搅拌溶解1h，调节pH至7.5±0.05。

(3).将步骤(2)所得溶液定量至100g，验证pH值，用0.2μm滤器过滤即可。

(三).CA19-9单克隆抗体偶联羧基磁珠制备步骤：

(1).取250μL磁珠，弃去上清，用MES缓冲液(100mM MES，pH5.0)500μL洗涤两次；加入1250μL缓冲液，充分混匀；超声分散20s，40％(4次×5s/次)。

(2).称取20mg Sulfo-NHS，溶于缓冲液100mM MES pH 5.0，浓度为25mg/ml，加575μL于步骤(1)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(3).称取10mg EDC，溶于缓冲液100mM MES pH5.0，浓度为20mg/ml，加250μL于步骤(2)所得的溶液中。(配制后2分钟内使用完)

(4).向步骤(3)所得溶液中补加缓冲液100mM MES pH 5.0至2.5ml(补425μL)。

(5).在血液混匀器上室温反应30分钟。

(6).磁吸弃上清，用2.5mL缓冲液100mM MES pH 5.0洗一次。

(7).复悬于1.25mL缓冲液100mM MES pH 5.0中，浓度为20mg/mL。

(8).超声分散20秒，功率40％。

(9).抗体预处理：取一支0.5mL Zeba离心式脱盐柱用缓冲液25mM MES pH 6.0平衡，0.3mL/次×6次，每次1500×g离心1分钟，之后取0.2mg抗体过脱盐柱，1500×g离心2分钟，收集至2mL尖头离心管中。

(10).将步骤(9)处理好的抗体加入到步骤(8)所得的活化的磁珠中，补足缓冲液100mM MES pH 5.0到2.5mL，磁珠浓度为10mg/mL。

(11).在血液混匀器上室温反应过夜(12小时)。

(12).磁吸收集步骤(11)所得溶液的上清2000μL于离心管中(蛋白浓度待测)，用100mM MES pH 5.0洗涤2次(5mL/次)。

(13).加2.5mL封闭液(封闭缓冲液)，在血液混匀器上室温反应4小时。

(14).磁吸步骤(13)所得的溶液弃上清，用25mM Tris-HCl pH 7.4洗涤3次(5mL/次)。

(15).将步骤(14)所得的偶联产物复悬于5mL磁珠缓冲液中，终浓度为5mg/mL。

(16).将步骤(15)所得的溶液用上述磁珠缓冲液稀释50倍即可得权利要求1或2所述试剂盒的磁分离试剂R1。

二.标记试剂R2的制备过程

(一).标记试剂缓冲液的配制过程，配制1L：

(1).称量Hepes 1.43g，NaCl 0.877g，MgCl₂ 0.04g，ZnCl₂ 0.0023g，NaN₃ 0.297g，羊血清0.75mL，牛血清4.45mL，BSA 0.81g，于烧杯中，加入50g纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为5.5±0.05。

(3).定量至100g，验证pH，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9单克隆抗体偶联吖啶酯制备步骤：

(1).抗体预处理：取一支0.5mL Zeba离心式脱盐柱用缓冲液25mM MES pH 6.0平衡，0.3mL/次×6次，每次1500×g离心1分钟，之后取0.2mg抗体过脱盐柱，1500×g离心2分钟，收集至2mL尖头离心管中。

(2).取步骤(1)预处理后的抗体，按抗体:吖啶酯＝1:30摩尔比例加入吖啶酯(5mM)10μL，补加吖啶标记缓冲液(0.1M PBS+0.15M NaCl，pH值8)至300μL，置于血液混匀器室温反应1小时。

(3).向步骤(2)所得的溶液中加入吖啶猝灭液(0.1M PBS+1％赖氨酸，pH值8.0)100μL，置于血液混匀器室温反应0.5小时。

(4).脱盐柱准备：用吖啶标记缓冲液平衡脱盐柱，平衡大约两个柱体积。

(5).将步骤(3)所得溶液过柱子除盐，收流出液1.5mL。

(6).通过紫外分光光度计测试OD280、OD370的吸光度，计算抗体浓度及标记比例。

(7).向步骤(5)所得溶液中加入1.5mL甘油保存。

(8).将步骤(7)所得的溶液用上述标记试剂缓冲液进行稀释，使得终浓度为0.8μg/mL，即可得权利要求1或2所述试剂盒的标记试剂R2。

三.CA19-9校准品及CA19-9质控品的配制

(一).CA19-9校准品缓冲液的配制，配制100mL：

(1).取Tris 1.808g，NaCl 0.877g，MgCl₂ 0.04g，ZnCl₂ 0.0023g，NaN₃ 0.297g，羊血清0.3mL，BSA 0.75g，于烧杯中，加入50mL纯化水，充分搅拌溶解。

(2).调节溶液pH，使pH值为8.0±0.05。

(3).转移容量瓶中，定容至100mL，用0.2μm滤器过滤即可。

(二).CA19-9校准品及质控品的配制：

用上述校准品稀释液稀释CA19-9抗原，配制六个校准品的浓度分别为：0、10、50、200、500、1000U/mL；CA19-9两个质控品的浓度分别为：50、500U/mL。

4.利用权利要求1～3任一项所述的一种糖类抗原CA19-9测定试剂盒定量检测CA19-9的方法，该检测方法步骤如下：

(1).加样：取9支试管，分别加入CA19-9校准品、质控品、待测样品各30μL。

(2).向步骤(1)中的试管中均加入60μL磁分离试剂R1及60μL标记试剂R2，用多管螺旋混匀器混匀，于37℃水浴锅中孵育15min。

(3).孵育完毕，将试管置于磁分离器上静置吸附3min，弃去上清液，并拍打磁分离器底部，使上清液尽可能分离干净。

(4).向步骤(3)所得试管中均加入300μL洗液，置于多管螺旋混匀器上混匀，然后置于磁分离器上静置吸附3min，弃去上清液，并拍打磁分离器底部，使上清液尽可能分离干净。

(5).重复步骤(4)两次。

(6).将步骤(5)试管置于化学发光检测仪上测定每管发光值(仪器自动向每管加入触发剂I(0.5％的H₂O₂)和触发剂II(0.2mol/LNaOH)各100μL)。