[发明专利]人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法、引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及人BRAF基因V600E突变状态的检测。

背景技术

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf murine sacoma viral oncogene homolog B1,BRAF)是迅速加速纤维肉瘤(rapidly Accelerated Fibrosarcoma，RAF)家族中的成员之一，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路中鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)下游的核心分子，是MEK/ERK激活途径中关键的激活因子，在调节细胞的生长、增殖和凋亡方面具有重要作用。

BRAF基因位于人染色体7q34，包含18个外显子，编码蛋白质分子全长约94Kd。BRAF主要有三个保守区，分别是CR1、CR2和CR3。其中CR3区为激酶的结构域，含甘氨酸环，是ATP的结合位点和主要激活区域，而且这区域的两个位点T598和S601的磷酸化对激活BRAF蛋白起着至关重要的作用。几乎BRAF基因上所有的突变都处于激酶结构域，主要是第600位密码子产生突变，包括V600E、V600K、V600R、V600D、V600M和V600L等，另外还有1798_1799ins、1799_1801del等。其中，V600E占据所有突变的80％左右。BRAF基因V600E突变可致使BRAF蛋白结构中V600E的氨基酸突变，使BRAF激酶发生持续性活化，激活MAPK通路，导致癌变。

BRAF基因突变与各种癌症相关，包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌和肺腺癌等。在66％的恶性肿瘤中都存在BRAF基因的错义突变。其中恶性黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌中发现了较大比例的BRAF突变。黑色素瘤中BRAF基因的突变率最高，约40％～68％转移性黑色素瘤发生BRAF突变。另外5％～8％结肠癌也发生BRAF突变。BRAF在甲状腺癌中突变率约为5％～20％，其中，在甲状腺乳头状癌亚型中突变率最高，为30％～70％。

2011年，首个BRAF V600E靶向抑制剂维罗非尼(Vemurafenib，Zelboraf)被FDA批准上市，用于治疗BRAF V600E突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果。2013年，FDA批准了达拉非尼(Dabrafenib，Tafinlar)用于治疗转移性黑色素瘤和不适合做手术治疗的黑色素瘤病人。达拉非尼是FDA继维罗非尼之后的第二个针对BRAFV600E突变的靶向分子药物。同年，FDA批准曲美替尼(Trametinib，Mekinist)治疗伴有BRAF V600E或V600K突变的不可切除或转移性黑色素瘤。曲美替尼是一个靶向MEK1和MEK2(mitogen-activated protein kinase)的激酶抑制剂。2014年，美国FDA批准曲美替尼与达拉非尼联用治疗晚期黑色素瘤皮肤癌。此外，BRAF基因V600E突变的群体还受益于多靶点药物索拉非尼(Sorafenib)和瑞格非尼(Regorafenib)。索拉非尼是一种针对CRAF和野生型以及V600E突变的BRAF的有效抑制剂。瑞格非尼是一种针对KIT、RET、RAF-1、BRAF等多靶点的激酶抑制剂。

目前普遍应用的BRAF基因V600E位点突变方法为TaqMan探针法和DNA直接测序等。TaqMan探针法是利用Taq酶3’>5’外切核酸酶活性，切断探针，释放荧光信号的方法。但是TaqMan探针法存在成本高昂、前期预实验周期较长的缺点。DNA直接测序是基于双脱氧核糖核酸链末端终止的原理，获得DNA碱基序列。该方法的缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。因此，以上两种方法都难适用于临床检测。而临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的BRAF基因V600E位点突变检测技术，满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。