[发明专利]人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法、引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.人BRAF基因V600E突变的PCR检测方法，其特征在于，步骤包括：

1)提取样本DNA并纯化；

2)以步骤1)所得DNA为模板，加入内参基因以及检测该内参基因的引物对和探针，使用特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对和探针，进行PCR扩增反应；

所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列，下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列；

所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列；

3)判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸；所述检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为人GAPDH基因，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为荧光定量PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.6～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物和探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，55～60℃退火10～60s，40～50个循环；步骤3)根据CT值判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR为数字PCR；步骤1)纯化后的DNA浓度为0.04～20ng/μL；步骤2)检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物的浓度为0.5～0.9μM，探针的浓度为0.1～0.5μM；PCR反应条件为：92～97℃预变性0.5～10min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50个循环；98℃灭活10min；步骤3)根据阳性拷贝数判断样本BRAF基因V600E位点的突变状态。

6.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物具有与SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的序列；所述下游引物具有与SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的序列。

7.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

8.根据权利要求6所述的引物对，其特征在于，所述上游引物的序列3’端的最后一个碱基上标记有锁核酸。

9.特异性检测人BRAF基因V600E位点突变状态的探针，其特征在于，所述探针具有与SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的序列。

10.根据权利要求9所述的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO:3所示。

11.检测人BRAF基因V600E突变的PCR反应试剂盒，其特征在于，包含有权利要求6-8任一项所述的引物对，以及权利要求9或10所述的探针。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，还包含有内参基因，以及检测内参基因的引物对和探针，所述检测内参基因的引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，探针的序列如SEQ ID NO:6所示。