[发明专利]一种外源萝卜片段特异标记及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种甘蓝型油菜外源萝卜片段特异标记和外源萝卜片段特异标记的制备方法及应用，通过甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料CLR650全基因组重测序数据和萝卜基因组草图信息比对，开发出外源萝卜片段的特异分子标记CLR9‑1～CLR9‑20。通过细胞质不育恢复材料CLR650回交群体的目标单株，获得BC₄分离群体；将BC₄群体中的可育株，采用混合法进行多世代混合选择，直至获得可育株所占比例超过75％的混合分离群体；最后通过多代自交进行纯合稳定，获得甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系。本发明克服了现有方法中恢复基因遗传力严重偏低、性状难以纯合稳定的障碍。

技术领域

本发明属于油菜育种技术领域和分子生物学领域，具体涉及一种外源萝卜片段特异标记和外源萝卜片段特异标记的制备方法，还涉及外源萝卜片段特异标记在甘蓝型油菜育种中的应用。

背景技术

油菜具有明显的杂种优势，是国内外应对食用植物油短缺、开拓可再生生物能源最具潜力的油料作物。萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)是甘蓝型油菜杂种优势利用的理想不育类型，是日本小仓于1968年在萝卜中发现的不育源而建立的细胞质雄性不育系统。由于该不育系统不育性非常稳定、彻底，在十字花科作物杂种优势利用中具有非常重要的价值。随着油菜分子生物学研究的不断深入，基因组测序技术得以完善，测序成本也进一步下降，分子标记的开发和辅助选择技术应用日益成熟和实用化，这为研究甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料提供了技术支撑。

Heyn于1976年通过属间杂交成功将萝卜的恢复基因导入到甘蓝型油菜(Heyn,1976)。随后，法国的Pelletier等人通过原生质体融合技术，也将欧洲萝卜中的恢复基因导入到甘蓝型油菜中。但由于恢复基因从萝卜转移至甘蓝型油菜时，冗余的萝卜片段也渗入到油菜基因组，导致恢复材料存在恢复能力不理想，部分雌性不育以及较高硫甙与恢复基因连锁等问题。

我国于上世纪80年代引入甘蓝型油菜ogura-CMS系统，全国各油菜育种单位随后开展了大量研究。如李旭峰曾报道将恢复基因从萝卜变种蓝花子导入油菜，但获得材料的恢复基因均处于附加体上，但不能稳定遗传；2015年，华金水等利用购自法国INRA的甘蓝型油菜恢复系R2000与不育系进行杂交后，对F₁代辐射诱变筛选标记发生改变的恢复单株，从而对R2000进行遗传改良，但其所用恢复源和分子标记均来源于国外已有研究。我国尚没有自主开发的可用于ogura-CMS恢复系育种的分子标记。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种基于基因组重测序技术和比较基因组学技术开发的目标基因特异标记及其制备方法和在甘蓝型油菜育种中的应用。本发明的特异分子标记来源于外源萝卜片段，制备方法简单易行，准确有效，与常规杂交、回交、混合选择、自交育种技术相结合，可有效解决目前我国甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系选育过程存在的远缘杂交外源目标基因遗传力严重偏低、性状难以纯合稳定等问题。

我们对湖南省作物研究所自主培育的新型甘蓝型油菜Ogu CMS恢复材料CLR650进行了大量分子生物学和细胞遗传学分析，结果表明该恢复材料染色体组已趋于稳定，其育性恢复基因为Rfo基因。基于CLR650杂交后代育性偏分离严重、性状难以稳定的问题，我们通过基因组重测序和参考基因组序列比对自主开发了外源萝卜片段的特异分子标记。所述的萝卜片段特异标记包括CLR9-1、CLR9-2、CLR9-3、CLR9-4、CLR9-5、CLR9-6、CLR9-7、CLR9-8、CLR9-9、CLR9-10、CLR9-11、CLR9-12、CLR9-13、CLR9-14、CLR9-15、CLR9-16、CLR9-17、CLR9-18、CLR9-19、CLR9-20。所述外源萝卜片段特异标记CLR9-1，其具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

所述外源萝卜片段特异标记CLR9-2，其具有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。

所述外源萝卜片段特异标记CLR9-3，其具有SEQ ID No：3所示的核苷酸序列。