[发明专利]一种基于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法

说明书

本发明公开了一种基于生物素化抗原或抗体‑无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法。属于免疫学检测领域。该方法利用链霉亲和素和生物素的快速高效特异性作用，将生物素化抗原或抗体‑无机盐杂化纳米花快速偶联到链霉亲和素修饰的酶标板上，解决了传统ELISA抗体包被需过夜反应的问题；其次，由于生物素化抗原或抗体‑无机盐杂化纳米花具有较高的稳定性，使其在常温条件下放置下仍有较好的活性；最后，所合成的生物素化抗原或抗体‑无机盐杂化纳米花具有三维层状结构，对后续抗体或抗原的捕获更为高效，有利于提高检测灵敏度。本发明提供的方法只需要提供生物素化的不同抗原或抗体，就能实现不同抗体或抗原的检测，具有高适用性。

技术领域

本发明涉及一种免疫学检测方法，尤其涉及一种基于生物素化抗原或抗体- 无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法。

背景技术

酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),指将可溶性的抗原或抗体吸附到固相载体上，利用抗原-抗体结合专一性，进行免疫反应的定性和定量检测方法。自从Engvall和Perlmann于1971年发明以来该方法得到了迅猛的发展，已广泛应用于各种抗原抗体的检测。

夹心ELISA方法是目前最为常用的抗原和抗体的检测手段，该方法具有操作简单、快速、灵敏等优点。其基本原理是，检测抗体时，把相应的抗原分子包被在聚苯乙烯固相载体上，加入被检测样品，孵育，洗涤，加入酶标抗抗体，再孵育、洗涤，然后加入酶底物显色，在酶标仪上读取数据，根据底物显色反应的强弱来判断被检样品中抗体的含量；检测抗原时，把针对该抗原的抗体分子包被在固相载体上，加入被检样品，孵育，洗涤，再加入被检抗原的另一种抗体(二抗)，孵育，洗涤，加入酶标抗二抗的抗体，再孵育、洗涤，最后加入酶底物显色，读数，根据颜色反应的强弱来判断样品中抗原的含量。

但是传统的酶联免疫吸附实验存在一些不足,例如抗体或抗原包被过程耗时长、费用高、批次间差异大，以及抗体或抗原需要严格的低温保存条件；此外尽管夹心ELISA方法敏感性高，但随着生命科学、医学和光学检测领域的发展，简单快捷的ELISA方法的敏感性依然亟待。因此，如何解决抗体或抗原包被时间过长、抗体或抗原稳定性差、抗体或抗原捕获效率较低等问题，实现快速高效检测成为当前酶联免疫吸附法研究的重点。

发明内容

针对传统酶联免疫吸附法(以下称为“2D ELISA”)存在的问题，本发明采用仿生合成的策略制备了生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花，构建了三维层状结构的免疫分析方法(以下称为“3D ELISA”)。该方法利用链霉亲和素和生物素的快速高效特异性作用，将生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花快速偶联到链霉亲和素修饰的酶标板上，解决了传统ELISA抗体包被需过夜反应的问题；其次，由于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花具有较高的稳定性，使其在常温条件下放置下仍有较好的活性；最后，所合成的生物素化抗原或抗体 -无机盐杂化纳米花具有三维层状结构，对后续抗体或抗原的捕获更为高效，有利于提高检测灵敏度(图1)。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

第一方面，提供一种基于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，将生物素化的抗原或抗体，与硫酸铜溶液一起加入到pH值为6.8～7.4的磷酸缓冲溶液中，得到生物素化的抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物，与链霉亲和素修饰的酶标板在37℃孵育，将孵育有生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶标板用于待测样品的酶联免疫吸附测定。

具体地，本发明的酶联免疫吸附测定方法包括以下步骤：

(a)将磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠解于去离子水中，调节混合溶液的pH值至6.8～7.4，得到磷酸缓冲溶液，再加入硫酸铜溶液和生物素修饰的抗原或抗体，摇匀后室温放置18h，得到生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物；