[发明专利]一种基于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法

权利要求书

1.一种基于生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，将生物素化的抗原或抗体，与硫酸铜溶液一起加入到pH值为6.8~7.4的磷酸缓冲溶液中，得到生物素化的抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物，与链霉亲和素修饰的酶标板在37℃孵育，将孵育有生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶标板用于待测样品的酶联免疫吸附测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（a）将磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠溶解于去离子水中，调节混合溶液的pH值至6.8~ 7.4，得到磷酸缓冲溶液，再加入硫酸铜溶液和生物素修饰的抗原或抗体，摇匀后室温放置18 h，得到生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物；

（b）将所得生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物离心得沉淀，用水洗涤2 ~4次，得洗涤后的生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物；

（c）将洗涤后的生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花复合物均匀分散在PBST缓冲溶液中, 置于链霉亲和素修饰的孔板中，37℃孵育30 ~ 120 min后，用洗液洗涤五次，再加入2% BSA溶液，于37℃封闭45min, 得包被有生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶标板，置于4℃保存备用；所述的洗液为PBST 缓冲溶液，其中磷酸盐缓冲溶液浓度为10mM ,NaCl的浓度为150mM, Tween 20的浓度为0.05%, pH为7.2；

（d）将待测样品加入包被有生物素化抗原或抗体-无机盐杂化纳米花的酶标板中，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应45 min；

（e）弃去上清液，PBST缓冲液洗涤五次，拍干，每孔加入50 μL HRP标记的抗目标物抗体，37℃反应45 min；

（f）温育后，弃去孔内液体，洗板5次，拍干，每孔加入TMB显色工作夜50μL，37℃避光显色10 min，依序每孔加硫酸终止液50 μL，终止反应，此时溶液颜色由蓝色立即转为黄色；

（g）用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值），或将溶液转入比色皿，放置于紫外-可见吸收光谱仪中，测其在450 nm波长处的吸收值，通过颜色深浅或吸收强度可对待测物进行可视化半定量检测或定量测定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（a）所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为0.1M，所述的硫酸铜溶液的浓度为10 ~ 200 mM，所述的生物素修饰的抗原或抗体为生物素修饰的甲胎蛋白AFP单克隆抗体，浓度范围为0.001~ 0.5 mg/mL；步骤（b）每次离心时的转速为10000 r/min，离心时间为10 min；步骤（e）所述的抗目标物抗体为抗AFP抗体，浓度为20μg/μL；步骤(f) 中硫酸终止液浓度为2M H₂SO₄。