[发明专利]北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明针对北极苹果特异性PGAS‑NOS邻接区序列设计引物和探针，建立北极苹果特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，扩增效率为96％，最低定量检测下限为20copies。有效的解决了现有技术中无北极苹果特异性精准定量检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫、国内农业产品食品监管的北极苹果及其产品的检测。

技术领域：

本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

背景技术：

北极苹果是由加拿大奥卡诺根特色水果公司(Okanagan Specialty Fruits，下称奥卡诺根公司)研发抗褐变品种，品牌名称为北极苹果(Arctic^TM)目前批准上市的北极苹果品系共有三个：2015年美国和加拿大批准上市的Arctic^TMGolden Delicious(GD743)和Arctic^TM Granny(GS784)，2016年美国批准上市的Arctic^TM Fuji(NF872)。

北极苹果(Arctic^TM)系列均由农杆菌介导载体GEN-03分别插入金冠(GoldenDilicious，GD743)、青苹果(Granny Smith，GS784)和富士(Fuji,NF872)研制而成，GEN-03载体包括嵌合的PPO(多酚氧化酶)抑制序列，含苹果PPO基因家族四个基因(PPO2，GPO3，APO5和pSR7，简称PGAS)的正向序列，它们由CaMV 35S(Cauliflower Mosaic Virus 35S)启动子和NOS(nopaline synthase)终止子调控。北极苹果(Arctic^TM)主要的外源基因为PPO抑制基因和nptII。北极苹果(Arctic^TM)是采用RNAi技术减少苹果中整个PPO基因家族的表达而生产抗褐变的苹果品系。其中PPO抑制基因产生双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)，它抑制转录的过程是由小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)通过序列互补直接剪切目标mRNA从而抑制PPO表达，产生抗褐变苹果。其中Arctic Fuji在第3、13和17号染色体上有多个GEN-03片段插入，序列PPO可能为4个有功能的拷贝，Arctic Golden的插入的PPO可能为1-2个拷贝，Arctic Granny可能为4个拷贝。

目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供北极苹果检测鉴定的方法，针对北极苹果构建特异性实时PCR检测方法。目前欧盟等其他国家和地区均尚无北极苹果特异性实时荧光PCR检测方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别北极苹果(包括GD743、GS784和NF872三个品系)特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Arctic-F：5’-TGACCCGAACCAGACCCAC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Arctic-R：5’-CAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种北极苹果特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：