[发明专利]北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒

权利要求书

1.一种北极苹果特异性实时荧光PCR检测引物组，包括检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Arctic-F：5’-TGACCCGAACCAGACCCAC-3’；

Arctic-R：5’-CAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTG-3’；

所述的检测探针如下所示：

Arctic-P：5’-TAACTTCTACTCCGCGGCTCGATCG-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；

所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。

2.一种北极苹果特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Arctic-F：5’-TGACCCGAACCAGACCCAC-3’；

Arctic-R：5’-CAGGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTG-3’；

所述的检测探针如下所示：

Arctic-P：5’-TAACTTCTACTCCGCGGCTCGATCG-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

3.一种北极苹果特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取样品的基因组DNA作为模板；

（2）加入权利要求1所述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；

（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为北极苹果；

所述的步骤（3）的根据扩增曲线判断样品是否为北极苹果的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为北极苹果；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是北极苹果。

4.根据权利要求3所述的北极苹果特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）的扩增反应体系为：25 μL，包括Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye II0.2 μL，10 μmol/L 检测引物Arctic-F和Arctic-R各0.5 μL，10 μmol/L 检测探针Arctic-P 0.5 μL，DNA 模板2 μL和ddH₂O 8.8 μL；所述的步骤（3）的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

5.一种北极苹果特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取北极苹果的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；

（2）反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数（lg）呈线性关系，据此得到该线性范围内北极苹果的标准曲线；

（3）提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤（1）中相同体系的权利要求1所述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤（2）获得的北极苹果的标准曲线方程，计算得到待检样品中北极苹果基因组DNA的含量。