[发明专利]检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测禽白血病病毒A/B/J亚群特异性抗体的均相化学发光试剂盒，其特征在于：包括发光微孔板、封口膜、受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ、供体微球、校准品和分析缓冲液；

所述受体微球Ⅰ上标记禽白血病病毒A/B亚群His-cENV蛋白，受体微球Ⅱ上标记禽白血病病毒J亚群His-gp85蛋白；所述供体微球标记兔抗鸡二抗；

所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将待标记物置于离心管中，加入磷酸盐缓冲液，离心、洗涤和悬浮，吸干上清后加入MES缓冲液，然后再依次加入经纯化的标记物、氰基硼氢化钠溶液和Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加HEPES缓冲液重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球；

所述保存液为50mmol/L 、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中包含6.05g/L的Tris、10g/L的海藻糖、10g/L的葡萄糖、30g/L的甘露醇、20g/L的牛血清白蛋白、5g/L的脯氨酸和体积分数为0.1%的Proclin-300；

校准品是由从多份高值血清混合成的阳性标准血清中提取的纯品抗体配制而成；

所述分析缓冲液为50mmol/L、pH7.4的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.8%的NaCl、质量分数为1%的牛血清白蛋白、质量分数为0.1%的酪蛋白、0.1%的表面活性剂S9、体积分数为0.1%的曲拉通-100、体积分数为0.05%的Proclin-300。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述供体微球为标记兔抗鸡二抗的AlphaScreen®供体微球。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述受体微球Ⅰ为标记His-cENV蛋白的AlphaPlex™ 645微球；受体微球Ⅱ为标记His-gp85的AlphaPlex™ 545微球。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球的标记过程是通过以下方法实现的：将20mg/mL的待标记物置于离心管中，向每0.2mL的待标记物中加入0.1mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液1mL，离心、洗涤和悬浮反复3～5次，吸干上清加入0.2mL的MES缓冲液，然后加入0.2mg～0.6mg浓度1～3mg/mL经纯化的标记物，再加入8～12uL浓度为400～500mmol/L的氰基硼氢化钠溶液和12.5uL体积分数为1%的Tween-20，2-8℃避光旋转反应40～48h后，加入10uL CMO避光37℃搅拌1h终止反应；离心去上清，加入50mmol/L pH7.4 的HEPES缓冲液0.5mL重悬，离心去上清，加入保存液，制得偶联标记物的受体微球Ⅰ、受体微球Ⅱ或供体微球。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品是由以下方法制得：将50份经检测的高值血清混合配制成阳性标准血清，10000rpm离心30min，再经亲和层析纯化，收集纯品抗体，将纯品抗体用安培瓶分装并冻干形成冻干粉，用分析缓冲液将冻干粉配制成6个校准品浓度：0ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、160ng/mL、640ng/mL和2560ng/mL。