[发明专利]一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：1)采用阳离子聚合物对一定大小的磁性纳米颗粒团簇进行修饰获得一种纳米载体；2)提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒；3)将步骤1)所得纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒共孵育获得一种纳米复合物；以及4)在磁场作用下，将步骤3)所得纳米复合物与T细胞共孵育，制得一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。根据本发明，提供了一种能对T细胞内目的基因进行简单、安全且高效编辑的方法，在肿瘤免疫治疗中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种磁性纳米材料介导的 CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗通过间接或者直接激活人体T细胞来清除肿瘤细胞，对多种肿瘤特别是晚期肿瘤的治疗具有良好的效果，且安全性很好。2013年，该方法被Science评为年度十大科技突破之首。在抗肿瘤免疫过程中，T细胞被T细胞受体(T cell receptor，TCR)介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。针对免疫检查点的阻断是增强T细胞激活的有效策略之一。目前，免疫检查点抑制剂相关抗体已被开发成药物并成功应用于肿瘤的免疫治疗中，但是该技术成本较高，病人的治疗费用十分昂贵，且副作用较大。

基因编辑技术，通过设计表达质粒等，靶向敲除T细胞内免疫检查点相关基因(如：PD-1，CTLA-4，TIM-3等)，从而降低甚至阻断免疫检查点的表达，是肿瘤免疫治疗的另一重要策略。目前，锌指核酸酶技术(ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶技术(TALEN)这两种基因靶向修饰技术应用到靶向编辑T细胞的研究中。但是，这两种技术均依赖于DNA特异性结合蛋白的合成完成基因打靶，其过程繁琐、耗时且费用昂贵，不利于普及和推广使用。RNA介导的CRISPR/Cas9技术作为第三代基因组编辑技术，使用序列特异性向导RNA分子(sequence-specific guide RNA，gRNA)引导核酸内切酶到靶点，完成目的基因组的编辑。该方法简单、成本低且编辑效率高，已对诸多类型细胞内的基因成功进行了编辑。但是，该方法对T细胞的编辑效果仍十分有限。原代T细胞是悬浮细胞且尺寸很小(约4～10μm)，使用常规脂质体技术很难进行转染。目前，研究人员使用电转或病毒载体技术虽然使转染效率有所改善，但这两种方法都存在缺点。电转过程会对细胞膜造成不可逆的损伤而导致细胞毒性。病毒载体免疫原性较大，极易产生细胞毒性，甚至插入基因组导致安全性问题。此外，病毒装载质粒过程较为繁琐，不利于普及和推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用，从而解决现有技术中肿瘤免疫治疗方法费用昂贵、副作用大、过程繁琐、甚至容易产生细胞毒性的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T 细胞内递送系统的制备方法，包括以下步骤：1)采用阳离子聚合物对一定大小的磁性纳米颗粒团簇进行修饰获得一种纳米载体；2)提供靶向目标基因的 CRISPR/Cas9系统表达质粒；3)将步骤1)所得纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒共孵育获得一种纳米复合物；以及4)在磁场作用下，将步骤3)所得纳米复合物与T细胞共孵育，制得一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。

根据本发明，步骤4)中的磁场包括均匀磁场和非均匀磁场。换句话说，本发明对于磁场没有特殊要求，使用常规磁场，无论是均匀磁场，还是非均匀磁场，均能实现高效的转染效果。