[发明专利]一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法

说明书

一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，属于纳米传感检测领域。本发明方法将凝血酶的两种适配体DNA分子分别修饰到Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子的表面，通过控制纳米粒子表面的DNA修饰量，在存在凝血酶的条件下通过适配体分子与凝血酶的结合，两种纳米粒子形成相间排列的链状结构，并具有较强的拉曼信号增强效果，凝血酶含量越高，链状结构越长，拉曼信号强度越强，根据凝血酶含量和拉曼信号强度的对应关系，可以实现凝血酶的定量检测。本发明方法操作简单、灵敏度高、并且可以实现血清样本中的凝血酶检测，同时这种纳米结构组装体为其它以适配体为识别分子的目标物检测提供了重要的理论基础。

技术领域

本发明属于纳米传感检测领域，具体涉及一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的主要载体，是生物功能的主要执行者，几乎所有的生理和病理过程均能引起蛋白质相应的变化，因此蛋白质检测在生命科学基础研究、人体健康评价、疾病诊断、药物和食品分析以及生物安全监控等方面具有很高的应用价值，而在生物医学诊断领域对与疾病相关蛋白的检测是一项非常重要的任务。

目前对于蛋白质检测的常用方法是基于抗原抗体特异性识别的免疫分析方法，主要包括蛋白质免疫印迹(Western Blot），酶联免疫吸附（ELISA）、亲和色谱和蛋白质芯片等，但是这种方法需要依赖于高灵敏高特异性的抗体的制备，而抗体的制备周期长、成本高，并且自身的稳定性易受环境温度、pH等条件的影响，从而导致抗体的活性和灵敏度降低，难以达到检测需求，使得此种方法存在一定的检测弊端。而基于色谱、质谱的仪器检测方法虽然具有较高的灵敏度，但是所需设备昂贵、需要专业的操作人员进行分析，在科研实验室中应用广泛，而限制了其广泛的应用。因此，开发高灵敏、高特异性、快速、准确、低沉本的检测方法局域非常重要的意义。

核酸适配体是通过体外筛选得到的一类单链DNA或RNA分子，这类分子能够发挥与抗体相同的亲和识别功能，但是具有优于抗体的特性，其可以体外大量合成，缩短了制备周期，DNA分子不易受环境等因素的影响，具有比抗体更高的稳定性，同时DNA分子易于修饰功能性基团，其引入的氨基、羧基、巯基、生物素、荧光素等分子更易进行传感检测方法的构建。因此随着纳米传感技术的发展，将纳米材料与适配体结合构建的纳米传感器在生物检测领域发挥着越来越重要的作用。其中应用最广泛的纳米粒子是纳米金、纳米银等贵金属纳米粒子，这种纳米粒子具有易于合成、小尺寸效应、表面效应、光学效应和良好的生物相容性。表面增强拉曼光谱是一种超灵敏的检测手段，甚至能达到单分子的检测水平，而金属纳米粒子的表面增强拉曼特性为SERS传感器的构建提供了重要的基底材料，由纳米粒子组装成的不同结构表现出不同的SERS增强效果，因此纳米组装体的研究成为SERS检测的重要研究方向。

发明内容

要解决的技术问题：对蛋白质进行检测的广泛应用的免疫学检测方法依赖抗体的使用，而抗体的制备周期长，并且抗体的稳定性容易受环境的影响，进一步影响检测结果的灵敏度和特异性。基于仪器的检测方法所需仪器价格昂贵，并且需要专业的操作人员进行复杂的样品前处理流程，限制了此类方法的普遍应用。

技术方案：一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法，包括如下步骤：

（1）Au@Ag纳米粒子修饰凝血酶的一段适配体

将新合成的Au@Ag纳米粒子在7000r/min的转速下离心10min，去除上清，用0.01MpH7.2的PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬并浓缩两倍，测得纳米粒子的浓度为20nM，然后将29bp的凝血酶适配体DNA分子加入到Au@Ag纳米粒子溶液中，使得其终浓度为50nM，在室温下孵育4h，将纳米粒子在7000r/min条件下进行离心，以除去未结合的DNA分子，再用PBS缓冲液将纳米粒子进行重悬；

29bp的适配体DNA序列：5’-SH-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’。