[发明专利]纯化聚乙二醇化蛋白质的方法

说明书

本申请是申请日为2010年11月24日，申请号为201080053284.0，发明名称为“纯化聚乙二醇化蛋白质的方法”的发明专利的分案申请。

发明领域

本发明涉及通过从含有聚乙二醇化(PEGylated)蛋白质的样品中去除杂质来纯化聚乙二醇化蛋白质(特别是，但不专指维生素K依赖性凝血因子例如因子IX (FIX))的方法，涉及用所述方法纯化的蛋白质，以及涉及所述纯化后的蛋白质在治疗中的用途，特别但并非唯一地涉及所述纯化后的蛋白质在用于治疗由凝血因子减轻的疾病中的用途，所述治疗例如血友病的预防性治疗。

发明背景

凝血是包括多种血液组分或因子的复杂相互作用的过程，这最终导致血纤蛋白血块。通常，参与被称为凝血“级联”的血液组分为酶原(proenzyme或zymogen)，即通过激活剂的作用而被转变为蛋白水解酶的无酶活的蛋白，所述激活剂本身为活化凝血因子。经过所述转变后的凝血因子通常情况下称作“活性因子”，并通过加上小写“a”后缀来命名(例如因子VIIa)。

需要活化因子("Xa")来将凝血酶原转变为凝血酶，其随后将血纤蛋白原转变为血纤蛋白，这作为形成血纤蛋白血块的最后阶段。有两个系统或途径促进因子X的活化。“内源途径”是指通过利用仅存在血浆中的因子而致使凝血酶生成的那些反应。一系列由蛋白酶介导的活化最终生成因子IXa，其与因子VIIa一起将因子X裂解为因子Xa。相同的蛋白水解通过在凝血的“外源途径”中的因子VIIa与其辅因子，组织因子来实现。组织因子为膜结合蛋白，并且通常不在血浆内循环。然而当血管破裂时，在Ca²⁺与磷脂存在下，其可与因子VIIa复合以催化因子X活化或因子IX活化。两种凝血途径在止血中的相对重要性尚不明确。

因子IXa (FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过生成作为X酶复合物一部分的大多数因子Xa而在止血过程中发挥关键作用，凝血期间需要所述因子Xa来支持凝血酶的正确生成(Hoffman M和Monroe D. M., III (2001) A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 85, 958-965中的综述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X-连锁的出血障碍血友病B的原因，所述血友病B影响约1:100,000的男性。这些血友病患者目前主要通过用重组或血浆-来源的凝血因子IX的替代疗法来治疗。

因子IX为维生素K依赖性凝血因子，其在结构上与因子VII、因子X和蛋白C相似。血浆半衰期为约18至30小时的循环的酶原形式由415个氨基酸组成，其可分为4个不同的结构域，所述结构域包括N末端的富含γ-羧基谷氨酸(Gla)结合域，两个EGF结构域，和C末端胰蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶结构域。因子IX的活化通过以下而发生：在Arg¹⁴⁵-Ala¹⁴⁶和Arg¹⁸⁰-Val¹⁸¹的有限蛋白水解释放35个氨基酸的片段，即所谓的激活肽(Schmidt A. E.和Bajaj S. P. (2003) Structure-function relationships in Factor IX and Factor IXa. Trends Cardiovasc Med 13, 39-45)。此激活肽高度糖基化，其包含个N连接和多达4个O连接聚糖。

蛋白质循环半衰期的延长可通过修饰蛋白质天然结构来实现。聚乙二醇化是已建立的一种用于延长蛋白质的循环半衰期的方法。因子IX (FIX)的糖聚乙二醇化(GlycoPEGylation)生成多种聚乙二醇化物质，例如单、二和三-聚乙二醇化物质。如此的组合因而为形成多种单聚乙二醇化和二聚乙二醇化物质提供了可能性。单聚乙二醇化形式已被鉴定为具有期需的药理学概况(profile)，并因而被选为优选的药物候选物。因此，从聚乙二醇化和非聚乙二醇化物质的混合物中分离单聚乙二醇化形式是期需的。

除了聚乙二醇化物质彼此分离及其与非聚乙二醇化物质的分离之外，纯化过程还必须提供充分减少的反应中所使用试剂。开发一种保证期需产物质量的方法是必要的，并且将有利的是，开发可提供充分减少的过程相关杂质(例如聚乙二醇化试剂、酶、来自试剂的副产物)以及产物相关杂质(例如非聚乙二醇化物质)的单个步骤纯化。

US 2008/207879 (Baxter Int)描述了rFIX的纯化过程，其包括将产物加入阴离子交换柱，和用超过200 mM的盐浓度洗柱子，以及用包含二价阳离子的洗脱缓冲液洗脱。