[发明专利]一种观察家鸽肠道肌间神经丛的方法

说明书

本发明涉及一种观察家鸽肠道肌间神经丛的方法，包括如下步骤：(1)向家鸽注射肌松药，制备待观察肠道；(2)取待观察肠道，结扎小肠的一端，用含有多聚甲醛的磷酸缓冲液灌注后，结扎小肠的另一端，置于含有多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定，转至含蔗糖的磷酸缓冲溶液中，4℃条件下脱水过夜，制得固定后样品；(3)制备待染样品；(4)将待染样品经漂染，冲洗，即得。本发明首次通过在制备样品前通过注射肌松药，并通过剥离纵形肌，较为容易的实现了环形肌与纵形肌的分离；解决了由于家鸽的肠壁较厚，环形肌和纵形肌结合紧密、难剥离，导致未剥离肌纤维影响神经丛的染色和观察的问题。

技术领域

本发明涉及一种观察家鸽肠道肌间神经丛的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

肠神经系统(enteric nervous system，ENS)由肠壁肌间神经丛和粘膜下神经丛等组成，对胃肠道功能起直接调节作用。为了解ENS的结构和构成神经元的类型，采用消化道全层铺片技术利用硝酸银、亚甲基蓝染色及免疫组化等方法进行观察，但以往的研究主要集中于大鼠、小鼠及豚鼠等哺乳动物的肠道神经系统的研究，对鸟类的研究很少。

鸟类与哺乳动物在进化上处于平行分支，它们的胃肠道在结构上明显不同，如鸟类有两个胃，分别为肌胃和腺胃，鸟类的小肠由十二指肠、空肠和回肠构成，大肠分为盲肠和直肠。鸟类的盲肠为一对盲管，是小肠和直肠结合处的一对肠道突起，不同的鸟类其肠道结构也不一样，如鸡的盲肠发达，而有的种类则退化或完全消失。家鸽是一对短的叉状突，左右各一。

值得注意的是，鸟类肠壁的环状肌位于纵肌层之外，这种结构相似于爬行类，而不同于哺乳动物。以往关于肠壁肌间神经丛集中在哺乳动物，仅有少部分文献研究鸡肠神经的超微结构。家鸽作为鸟类的典型代表，其肠道肌间神经丛，不同肠段分布特点，还未见研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种观察家鸽肠道肌间神经丛的方法。

本发明技术方案如下：

一种观察家鸽肠道肌间神经丛的方法，包括如下步骤：

(1)按0.04～0.06mg/kg向家鸽注射肌松药，5～30min后处死家鸽，取家鸽肠道，清理肠道内容物，制得待观察肠道；

(2)取步骤(1)制得的待观察肠道，结扎小肠的一端，用含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4％的磷酸缓冲液灌注后，结扎小肠的另一端，在4℃条件下，置于含有多聚甲醛质量百分比浓度为3.6～4.4％的磷酸缓冲液中固定6～8h，转至含200～350g/L蔗糖的磷酸缓冲溶液中，4℃条件下脱水过夜，制得固定后样品；

(3)将步骤(2)制得的固定后样品截段后，剥离肌层，将肌层浆膜面向下平铺于载玻片上，然后剥离神经丛上的纵形肌，保留环形肌层，置于磷酸缓冲液中保存，制得待染样品；

(4)将步骤(3)制得的待染样品经质量浓度为0.04～0.06％的亚甲基蓝溶液漂染45～90s，蒸馏水冲洗，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，家鸽优选体重300～340g。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，肌松药的注射量为0.05mg/kg。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，清理肠道内容物为用含浓度为10^-4mol/L尼莫地平的质量浓度0.75％的磷酸缓冲液冲洗。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，小肠为按解剖位置分离的小肠。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，磷酸缓冲液为含有多聚甲醛质量百分比浓度为4％的磷酸缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，截段为剪成1cm长的肠段。