[发明专利]羧基化聚乳酸羟基乙酸包裹PFOB纳米超声造影剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种羧基化聚乳酸羟基乙酸包裹PFOB纳米超声造影剂的制备方法。

背景技术

目前的纳米超声造影剂有多种，是由不同的壳(聚合物，磷脂)包裹不同的核(气体，液体，固体)构成，可以产生超声对比增强。纳米气泡的稳定性差，在体外就容易发生破裂和融合。在体内，纳米气泡还受拉普拉斯压力、血压和网状内皮细胞的吞噬，半衰期只有短暂几分钟，对肿瘤的选择性差。固体颗粒虽然很稳定，但是在体内难以降解，反复使用会引发蓄积效应，还会引起肝损伤。液体内核的超声造影剂对压力和机械力有良好的耐受性而受到关注。PFOB(全氟辛溴烷，C₈F₁₇Br)是一种液态氟烷，具有良好的安全性和生物相容性，不在体内代谢，通过呼吸排出体外。当PFOB颗粒聚集在特定目标时，可以形成声阻抗失匹配进而产生声反射，反射的超声波被成像系统检测而形成图像对比。以PFOB为内核的纳米超声造影剂的研究已有报道，但是由于液态内核相对不可压缩性以及小直径，产生的超声对比增强弱，局限于体外显影和超高频率(>20MHZ)的探头下显影，体内经静脉注射后仅可在下腔静脉短暂显影，在肿瘤部位不能产生超声对比增强。

包裹PFOB的纳米超声造影剂体内外显影的关键是纳米颗粒在体外应具有良好地超声增强效果，这要求纳米颗粒形成完整核壳结构，并且有较薄的囊壳厚度。目前常用PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)包裹PFOB制备纳米超声造影剂。采用乳化溶剂挥发法制备。该方法在溶剂挥发阶段，体系中将会出现三相——水相(含表面活性剂)、油相(含PLGA)和PFOB相。若是条件适宜，CH₂Cl₂-PLGA相会完全包裹PFOB，此后伴随CH₂Cl₂的继续挥发，PLGA将在PFOB外围形成一种完整均匀的固态囊壳(说明书附图图1)；但如果PLGA未能扩散成连续的单层膜，则不能形成典型的壳-核结构，而是以半包裹的“橡子”状或者完全分离的状态存在。

因此，需要开发一种造影能力强、PLAG均匀包裹PFOB的超声造影剂。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种羧基化聚乳酸羟基乙酸包裹PFOB纳米超声造影剂的制备方法，目的是通过采用羧基化聚乳酸羟基乙酸包裹全氟辛溴烷制备纳米颗粒，制备出在医用超声频率下，在体内外具有良好的显影能力的造影剂，该造影剂经静脉注射后，对荷瘤裸鼠的皮下肿瘤产生持续超声对比增强。

本发明的羧基化聚乳酸羟基乙酸包裹PFOB纳米超声造影剂的制备方法按照以下步骤进行：

(1)合成PLGA-PEG-COOH：

称取PLGA-COOH 1.00g，加入重蒸氯仿5mL，涡旋使PLGA-COOH溶解在氯仿中；

将32mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、50mg EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶于1mL重蒸氯仿中，涡旋后滴加到PLGA-COOH的氯仿溶液中，室温磁力搅拌反应12h，得淡黄色澄清透明粘稠液，加入5mL-20℃冰甲醇沉析，反复洗涤后45℃真空干燥2h得活化酯PLGA-NHS；

称取1.00g活化酯PLGA-NHS，加入3mL重蒸氯仿，涡旋使活化酯PLGA-NHS溶解在氯仿中，然后加入250mg NH₂-PEG-COOH和72mg或92μL的N,N-二异丙基乙胺，室温磁力搅拌反应24h，加入预冷甲醇沉析，反复洗涤后45℃真空干燥24h，即得PLGA-PEG-COOH；

(2)制备纳米UCA(超声造影剂)：

配置分子量为13K～23K的1％PVA(聚乙烯醇)水溶液，称取PVA 1g，加入100mL超纯水，静置溶胀过夜，在80℃水浴条件下磁力搅拌30min，待PVA溶解且溶液为透明时冷却至室温，4℃下保存；

配置有机相：称取混合膜材PLGA-PEG-COOH和PLGA-COOH 100mg置于西林瓶中，先后加入4mL CH₂Cl₂和60μL PFOB，避光室温放置约30min，待膜材料完全溶解且瓶底不见PFOB液滴后即得澄清透明有机相；

乳化：取20mL1％PVA水溶液于50mL玻璃离心管内，将上述有机相吹打后转移至管内，冰浴条件下8000rpm高速剪切2min，得到微米级牛奶样初乳，将初乳在冰浴条件下用超声细胞粉碎仪粉碎2min，得到纳米级乳白色复乳；