[发明专利]携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

说明书

本发明涉及一种携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的构建方法及其产品和应用，将带鸭坦布苏病毒全长cDNA的感染性克隆的质粒经过改造，将海肾荧光素酶的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建出插入了RLuc基因的全长TMUV报告病毒的感染性克隆的质粒，再用高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录本后，转染BHK21细胞拯救出报告病毒，由于海肾荧光素酶具有出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测，因而可以通过检测RLuc的活性来反映病毒的复制情况，可用于研究TMUV的生命周期、复制机制，抗TMUV试验，病毒蛋白与宿主的相互作用等多方面的机制等多方面的研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的构建方法，还涉及由该方法制得产品及产品的应用。

背景技术

我国是世界养禽大国，更是世界最大的养鸭国。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusuvirus，DTMUV)病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。

DTMUV属黄病毒科，黄病毒属，基因组为不分节段的单股正链RNA，约由10990个核苷酸组成，包含一个开放阅读框，编码一个3425aa的多聚蛋白。在宿主信号肽酶和病毒自身蛋白酶NS2B/NS3的切割作用下，产生3个结构蛋白(capsid[C]蛋白，premembrane[prM]蛋白，envelope[E]蛋白)，和7个非结构蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5；两端被5’UTR和3’UTR结构包围，分别长约94nt和618nt，病毒基因组RNA的5’端有帽子结构，3’端无poly(A)结构。

目前的研究对DTMUV的研究并不深入，报道主要集中与病毒的分离及鉴定。其致病机制，免疫逃避等分子机制，各种蛋白的结构功能还有待于进一步的研究，才能确定与其他黄病毒属是否一致，是否存在差异性，而有关鸭坦布苏病毒的各个蛋白的作用也还有待深入的研究与证明。由于当前对该病的防控措施尚不完善，因此，该病每年仍对我国养鸭业造成几十亿元的经济损失，切实安全、高效的DTMUV疫苗亟待研制和应用。

经典遗传学遵循从生物的表型、性状再到遗传物质的研究路线，来研究生命发生、发展的规律。而反向遗传学(reverse genetics)技术开辟了另外一条研究思路，即从遗传物质向生物性状、表型进行研究的手段。狭义的反向遗传学特指针对微生物的反向遗传操作，尤其是病毒的反向遗传操作，在RNA病毒研究中亦称作RNA感染性克隆技术。该方法具有定点改变、操作可控等优点。由于多数基因工程技术主要以DNA为对象，较DNA病毒研究而言，RNA病毒的反向遗传操作更为复杂，难度更大。针对不同的RNA病毒其反向遗传操作技术手段也不一。目前，多种RNA病毒的感染性克隆已成功构建，该技术的应用对于病毒学研究具有重大的推动作用。