[发明专利]携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

权利要求书

1.携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以pRL-TK质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物，PCR扩增获得RLuc表达盒，记为B片段；

（2）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增，分别扩增得A片段和D片段，再以pACYC FL-TMUV质粒为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增，扩增得片段C，然后用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示序列为引物，A片段和B片段为模板进行PCR扩增，获得A片段和B片段的融合片段，命名为AB片段，再以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8所示序列为引物，AB片段和C片段为模板进行PCR扩增，获得AB和C片段的融合片段，命名为ABC片段；最后在以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示序列为引物，ABC片段和D片段为模板进行PCR扩增，获得ABC片段和D片段的融合片段，命名为RLuc-P1片段；

（3）将步骤（2）获得的RLuc-P1片段与经SpeI和XhoI进行双酶切后的pACYC 177A质粒连接，获得重组质粒，命名为pACYC RLuc-P1质粒；

（4）以pACYC FL-TMUV质粒为模板，分别以SEQ ID NO.12与 SEQ ID NO.13，和SEQ IDNO.14与 SEQ ID NO.15所示序列为引物进行PCR扩增，扩增得到P2-3片段和P4-6片段，将P2-3片段与pACYC RLuc-P1质粒通过XhoI和EcoRV酶切位点进行亚克隆，获得中间载体pACYC RLuc-P1-3，再将P4-6片段通过EcoRV和NotI酶切位点亚克隆到pACYC RLuc-P1-3，获得携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体，命名为pACYC RLuc-TMUV质粒；

（5）用NotI将pACYC RLuc-TMUV质粒单酶切线性化，体外转录RNA，然后将转录的RNA转染BHK21细胞拯救出报告病毒；

所述pACYC FL-TMUV质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pACYC 177A质粒的序列如SEQ ID NO.11所示。

2.由权利要求1任一项所述的方法拯救的携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体。

3.权利要求2所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在作为鸭坦布苏报告病毒研究工具中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告病毒生命周期中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告病毒复制机制中的应用。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒载体在研究鸭坦布苏报告抗病毒药物中的应用。