[发明专利]一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)有“白色三文鱼”之称，具有蛋白质含量高，生长快，抗病能力强，对环境污染少等特点，是联合国推荐养殖的优质水产养殖品种。我国于1978年引入尼罗罗非鱼种鱼，1983年中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心夏德全研究组又引入奥利亚罗非鱼种鱼，经多年的选育，逐渐育成体壮种纯的优良品系。经过三十多年的发展，我国已成为罗非鱼养殖产量最大的国家，年产量达150万吨，占全世界总产量的50％，产品常年出口美国、欧盟和俄罗斯等国家。但自2009年以来，我国罗非鱼主养区每年夏季持续爆发罗非鱼链球菌病，累计死亡率可达95％，年损失约10-15亿元，造成了巨大的经济损失，该病严重危害罗非鱼养殖产业的发展，因此对罗非鱼链球菌病的防控非常必要。

有颌鱼类产生的抗体类型主要是IgM，高纯度罗非鱼IgM及其酶标抗体的制备是研究罗非鱼免疫应答、免疫检测方法的基础，为罗非鱼的疫病防控提供技术支持，但市场上尚无商品化的抗罗非鱼IgM的标记二抗出售。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其采用亲和层析的方法，制备高浓度的兔抗罗非鱼IgM的多克隆抗体，纯化后进行辣根过氧化物酶标记和标记后抗体浓度测定，效价大于1：128000。

本发明的另一个目的为提供一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体。

为了实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体，其特征在于，将兔抗罗非鱼IgG抗体用辣根过氧化酶标记，作为酶标二抗。

一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采集罗非鱼血清，用Protein G亲和纯化得到罗非鱼IgM抗体，再将罗非鱼IgM抗体免疫新西兰大白兔，得到兔抗罗非鱼IgG抗体，通过辣根过氧化酶对兔抗罗非鱼IgG抗体进行标记。

罗非鱼IgM抗体的制备过程为：用Protein G琼脂糖亲和介质填装层析柱，将断尾取血法所得罗非鱼血清与PBS缓冲液等量混合后缓慢上样，待抗原抗体充分结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需的罗非鱼IgM抗体，立即在PBS缓冲液中进行4℃透析过夜，收集透析袋内液体，得到纯化的罗非鱼IgM抗体。

兔抗罗非鱼IgG抗体的制备过程为：将纯化的罗非鱼IgM抗体通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，免疫2-2.5KG的新西兰白兔，选择背部多点注射法，皮下免疫400ug/次，每2周免疫一次，每只白兔一共免疫4次；采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清的效价，待效价大于1:50000进行最终的心脏采血、分离血清的操作。

得到兔抗罗非鱼IgG抗体后，纯化兔抗罗非鱼IgG抗体，纯化过程为：将罗非鱼IgM与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将兔抗罗非鱼IgG抗体的制备过程得到的兔抗血清与PBS缓冲液等量混合后缓慢上样，待抗原抗体充分结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，收集透析袋内液体，得到纯化的兔抗罗非鱼IgG抗体，并进行纯度、浓度和效价测定，保存备用；

得到纯化的兔抗罗非鱼IgG抗体后，进行兔抗罗非鱼IgG抗体的酶标记：称取足量辣根过氧化物酶(HRP)，用双蒸水溶解，同时称取足量NalO₄，用双蒸水溶解；每毫升HRP溶液中加入200ul NalO₄溶液，避光反应后，加入1/10体积的乙二醇；用醋酸钠溶液4℃透析过夜，将透析后的液体取出，加入碳酸盐溶液调整pH值；按照质量比HRP：抗体＝1：1的比例将抗体与HRP混合，室温避光反应，然后加入4mg/ml的硼氢化钠至终浓度50ul/ml，室温避光反应；将上述溶液置于PBS缓冲液中4℃透析过夜，期间换液两次，得到再次透析后的含标记后抗体的液体；再次透析后的液体，按10mg/ml的抗体浓度加入到PBS缓冲液，加硫柳汞至终浓度为0.01％，-20℃避光保存。

对标记后抗体进行ELISA效价检测，标记抗体的效价大于1：128000。

相对于现有技术，本发明的有益效果：

本发明采用亲和层析的方法，制备高浓度的兔抗罗非鱼IgM的多克隆抗体，纯化后进行辣根过氧化物酶标记和标记后抗体浓度测定，效价大于1：128000，通过适当稀释用于免疫反应中，用于检测罗非鱼IgM，有助于罗非鱼链球菌病的规模化防控。

附图说明