[发明专利]一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体及制备方法

权利要求书

1.一种用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体，其特征在于，将兔抗罗非鱼IgG抗体用辣根过氧化酶标记，作为酶标二抗。

2.一种如权利要求1所述的用于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采集罗非鱼血清，用Protein G亲和纯化得到罗非鱼IgM抗体，再将罗非鱼IgM抗体免疫新西兰大白兔，得到兔抗罗非鱼IgG抗体，通过辣根过氧化酶对兔抗罗非鱼IgG抗体进行标记。

3.根据权利要求2所述的于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，罗非鱼IgM抗体的制备过程为：

用Protein G琼脂糖亲和介质填装层析柱，将断尾取血法所得罗非鱼血清与PBS缓冲液等量混合后缓慢上样，待抗原抗体充分结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需的罗非鱼IgM抗体，立即在PBS缓冲液中进行4℃透析过夜，收集透析袋内液体，得到纯化的罗非鱼IgM抗体。

4.根据权利要求3所述的于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，

兔抗罗非鱼IgG抗体的制备过程为：

将纯化的罗非鱼IgM抗体通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，免疫2-2.5KG的新西兰白兔，选择背部多点注射法，皮下免疫400ug/次，每2周免疫一次，每只白兔一共免疫4次；采血检测，通过间接 ELISA 方法确定抗血清的效价，待效价大于1:50000进行最终的心脏采血、分离血清的操作。

5.根据权利要求4所述的于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，得到兔抗罗非鱼IgG抗体后，纯化兔抗罗非鱼IgG抗体：

将罗非鱼IgM与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将兔抗罗非鱼IgG抗体的制备过程得到的兔抗血清与PBS缓冲液等量混合后缓慢上样，待抗原抗体充分结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，收集透析袋内液体，得到纯化的兔抗罗非鱼IgG抗体，并进行纯度、浓度和效价测定，保存备用。

6.根据权利要求5所述的于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，得到纯化的兔抗罗非鱼IgG抗体后，进行兔抗罗非鱼IgG抗体的酶标记：

称取足量辣根过氧化物酶（HRP），用双蒸水溶解，同时称取足量NalO₄，用双蒸水溶解；每毫升HRP溶液中加入200ul NalO₄溶液，避光反应后，加入1/10体积的乙二醇；用醋酸钠溶液4℃透析过夜，将透析后的液体取出，加入碳酸盐溶液调整pH值；按照质量比HRP：抗体=1：1的比例将抗体与HRP混合，室温避光反应，然后加入4mg/ml的硼氢化钠至终浓度50ul/ml，室温避光反应；将上述溶液置于PBS缓冲液中4℃透析过夜，期间换液两次，得到再次透析后的含标记后抗体的液体；再次透析后的液体，按10mg/ml的抗体浓度加入到PBS缓冲液，加硫柳汞至终浓度为0.01%，-20℃避光保存。

7.根据权利要求6所述的于罗非鱼IgM检测的酶标抗体的制备方法，其特征在于，对标记后抗体进行ELISA效价检测，标记抗体的效价大于1：128000。