[发明专利]一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法

说明书

本发明提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，直接利用分离方法简单、来源丰富的人外周血单个核细胞(即PBMCs)，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内将PBMCs诱导并扩增成为包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim两种调节性T细胞在内的复合型Treg。这种复合型Treg纯度高、兼具两种Treg的调节功能、具有抗原非特异性，有广泛应用于致病抗原不明确、难治性T细胞介导的自身免疫性疾病治疗的前景。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法。

背景技术

在很多自身免疫性疾病的发生发展过程中，T细胞针对自身抗原的异常激活发挥关键的作用。调节性T细胞对异常免疫应答具有强大的免疫调节作用，如能体外扩增足够数量的自体抗原非特异性调节性T细胞进行体内回输，将很可能抑制体内发生的异常免疫应答，从而使自身免疫性疾病得到控制。此外，自体调节性T细胞回输体内后不会发生针对异己的免疫性破坏，因而可能存活和发挥较长时间的作用。在器官移植的情况下，器官捐献者(供者)与接受移植者(受者)是遗传背景不同的个体，因此，不可避免会发生急、慢性免疫排斥反应，而这正是影响移植治疗效果最主要的原因。介导免疫排斥反应的主体是受者体内的效应性淋巴细胞，它们识别外来移植物抗原后活化、增殖并分泌大量效应分子，直接和/或间接地导致移植物损伤，目前，需要终身使用免疫抑制剂来控制效应细胞的功能，但是，长期服用免疫抑制剂会带来感染、恶性肿瘤、心血管疾病、肝肾毒性等毒副作用，而且还无法阻止慢性排斥所导致的移植物功能丧失。因此，人们正努力寻找新的控制排斥反应的方法，以替代这些化学药物。大量实验研究表明，人体内存在一类具有免疫负性调节功能的细胞，能有效抑制效应细胞的功能，其中最重要的是调节性T细胞(Treg)。获得足够数量Treg的方法主要分两类，一类是分离出天然存在于机体内的Treg，然后在体外扩增，由于天然Treg的数量极少，需要进行多个周期的增殖培养(每6～7天为一个周期)，然而在此过程中，Treg的调节能力容易丢失；另一类方法是分离出机体内大量存在的静息T细胞(naive T细胞)，然后在体外利用抗原呈递细胞诱导培养出Treg，其具有抗原特异性，只能抑制能与供者抗原起作用的效应细胞，从而避免广泛的免疫抑制，尽管该类方法有众多的诱导方案，但几乎都受到诱导条件的限制(如抗原呈递细胞不易获取、价格昂贵、操作复杂、不符合临床标准等)而仅适合于实验研究，不利于临床开展。

发明内容

基于调节性T细胞(即Treg)具有良好的抑制免疫应答作用，体外诱导扩增的Treg可能应用于治疗T细胞介导的自身免疫性疾病或应用到器官移植领域诱导同种抗原免疫耐受。与抗原特异性Treg相比，抗原非特异性Treg应用适应症可能更为广泛，但目前现有技术存在的最大问题是体外诱导调节性T细胞成本昂贵、耗时长、诱导效率较低、表型及调节作用不稳定等。本发明利用物极必反原理，采用文献从未报道过的全新方法，直接利用分离方法简单、来源丰富的人外周血单个核细胞(即PBMCs)，经过能符合临床药品生产质量管理规范(GMP)的简便诱导方法，在短期内PBMCs诱导并扩增成为包含CD4⁺CD25⁺CD127^dim和CD8⁺CD25⁺CD127^dim两种调节性T细胞在内的复合型Treg。这种复合型Treg纯度高、兼具两种Treg的调节功能、具有抗原非特异性，因此有可能广泛应用于致病抗原不明确、难治性T细胞介导的自身免疫性疾病的治疗。

本发明提供了一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMCs；