[发明专利]一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法

权利要求书

1.一种直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤包括：

S1、从人外周血中分离出外周血单个核细胞PBMCs；

S2、将PBMCs重悬于含5～10％AB型人血清或自体血清的AIM-V CTS培养基，计数细胞总量，加入1:1数量的抗CD3/CD28磁珠和终浓度为500～1000U/ml的rhIL-2，刺激培养6～7天诱导结束，培养过程中每3天补加一次rhIL-2；

S3、磁场去除抗CD3/CD28的磁珠，计数诱导后所获得的活细胞数量，取少量细胞进行T细胞进行表型和纯度的鉴定；

S4、将剩余诱导后的T细胞重悬于含5～10％人血清的AIM-V CTS培养基，加入终浓度为100～200U/ml的rhIL-2，培养22～26h以静息诱导后的T细胞，分选活细胞；

S5、取部分步骤S4获得的活细胞进行混合淋巴细胞培养，其余细胞用生理盐水重悬。

2.如权利要求1所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S5所述混合淋巴细胞培养为：以步骤S1所述PBMCs为反应细胞，直接将抗CD3/CD28抗体作为刺激源提供T细胞激活的第一及第二信号，进行混合淋巴细胞培养，在混合淋巴细胞培养体系中加入步骤S4所述分选的活细胞共同培养3～6天，通过流式细胞术检测反应细胞的增殖水平。

3.如权利要求2所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：所述反应细胞与分选的活细胞添加量之比为1:1～1:0.125。

4.如权利要求1所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S1所述分离出外周血单个核细胞PBMCs的方法为Ficoll分离法或采用血细胞分离机及配套管路采集PBMCs。

5.权利要求4所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：所述Ficoll分离法的步骤包括：向人外周血中加入等体积生理盐水稀释并混匀后，利用人Ficoll淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞。

6.如权利要求1所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S3所述表型和纯度的鉴定包括通过流式细胞术检测CD3、CD19、CD4、CD8、CD27、CD95、CD45RA、GITR、CD127、CD25、Foxp3、CTLA-4、CD62L、CXCR3分子的表达。

7.如权利要求1所述的直接体外诱导人外周血单个核细胞成为复合型抗原非特异性调节性T细胞的方法，其特征在于：步骤S5所述生理盐水含2％人血清白蛋白。