[发明专利]高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法及其应用，所述的培养方法包括以下步骤：1)将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株在1号培养基中逐级放大培养；2)将放大培养后的细胞转入生物反应器中进行发酵培养，在2号培养基中进行搅拌培养，发酵培养初期培养温度为36.5～37.5℃，pH为7.05～7.25，从发酵培养的120±2h开始，将培养温度下调至31.5～32.5℃，并将pH下调至6.90～7.10；在整个发酵培养的过程中，控制溶氧为20％～60％；在生物反应器中发酵的第12天后，收获细胞发酵液。本发明的培养方法获得的猪瘟E2蛋白产高、且具有更好的可操作性和实用性，因此，本发明更有利于扩大培养规模。

技术领域

本发明涉及CHO细胞的发酵培养方法和应用，属于细胞工程领域。

背景技术

猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。

猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，依次为Npro,C,Erns,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B，其中C,Erns,E1和E2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

本发明人在申请号为201710409930.6的发明专利申请构建了一株高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株，该细胞株在摇瓶培养时产量能够达到1g/L。为了进一步提高该细胞株的表达产量以降低疫苗生产成本，以及进一步适应规模化的工业化生产以方便后续工业化大规模生产，本发明人在摇瓶发酵的基础上，进一步研究了该细胞株的大规模的细胞培养方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的大规模培养方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法，所述的培养方法包括以下步骤：1)将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株在无血清培养基中逐级放大培养；2)将放大培养后的细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的初期培养温度为36.5～37.5℃，pH为7.05～7.25；从发酵培养的120±2h开始，将培养温度下调至31.5～32.5℃，并将pH下调至6.90～7.10，其中，需在96±2h和216±2h时添加无血清培养基；在整个发酵培养的过程中，控制溶氧为20％～60％；在生物反应器中发酵的第12天后，收获细胞发酵液。

本发明的技术方案中，优先地，步骤1)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL302且含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。

本发明的技术方案中，优先地，步骤2)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL302且不含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。