[发明专利]一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒采用PCR体外扩增法，用于定性检测人全血样本中乙醛脱氢酶ALDH2*2 第1510位点的基因多态性。

背景技术

线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）同时具有乙醛脱氢酶和酯酶活性，参与乙醇、硝酸甘油等药物的代谢。ALDH2代谢活化硝酸甘油成其活性代谢产物一氧化氮。ALDH2*2（Glu504Lys，rs671）多态导致所编码蛋白质504位谷氨酸被赖氨酸所取代，携带突变等位基因（ALDH2*2）的个体ALDH2酶活性下降，杂合子个体酶活性仅为野生型个体的10％，突变纯合子个体酶活性缺失。因此，携带ALDH2*2等位基因的个体酒精代谢能力下降，少量饮酒即出现脸红、心跳加速等不适；代谢硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效应减弱。亚洲人群中ALDH2*2等位基因的携带率为30~50％。携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者应尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油含服无效。因此，定性检测ALDH2的基因多态性，可以用于筛选酒精代谢能力人群和指导硝酸甘油用药。

目前临床或实验室检测ALDH2基因多态性的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交（ISH）等多种方法。

PCR-直接测序法也称PCR-Sanger测序。PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。该方法属于定性检测。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

PCR-焦磷酸测序法需设计一条生物素标记的测序引物，当引物与单链模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。主要缺点：对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；检测灵敏度有限，对肿瘤组织中的低丰度体细胞突变（<3％）容易出现假阴性；测序长度仅10多个碱基，不能对长片段进行分析。

实时荧光PCR法可分为探针法和非探针法两种，前者利用与靶序列特异杂交的探针（Taqman和分子信标）来指示扩增产物的增加，后者利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。本方法主要适于对少量位点、大样本进行分型。

PCR-基因芯片法以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其有规律地排列固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等程序，按碱基配对原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对芯片上的荧光信号进行检测和分析，从而迅速获得个体的基因型信息。该方法用于DNA基因分型时属于定性检测，灵敏度为50 ng/μL。

PCR-电泳分析是指对待分析的目的基因片段进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析，根据PCR产物的大小对基因多态性位点进行基因分型。PCR过程中需建立阳性质控品和阴性质控品，电泳分析时需同时用分子量标记物进行片段大小的判断。当分子量标记物反应管无条带或出现较弱的条带时，可能的原因包括点样孔漏、荧光染料不够或失效、电泳时间过长或电压过大。该方法的优点是成本低，在普通实验室即可开展；缺点是只适合对DNA插入/缺失多态性或融合基因进行定性测定，不能用于SNP的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种ALDH2*2基因型检测试剂盒及其检测方法，利用该试剂盒能够快速、简便地检测ALDH2*2 基因第1510位点的类型。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ALDH2*2基因型检测试剂盒，包括KOD DNA 聚合酶、上游引物、下游引物、特异性靶向荧光探针、GG型阳性参考品、AA型阳性参考品以及AG型阳性参考品；

所述上游引物为针对人ALDH2*2基因设计的上游引物，上游引物的序列为5’-CCCAGTCACCCTTTGGTGGCTAC-3’ （如SEQ NO:1所示）；