[发明专利]检测霍乱弧菌的RPA-IAC引物及方法

说明书

本发明提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对及内标扩增序列在制备检测或辅助检测霍乱弧菌的产品中的应用；以及基于RPA‑IAC技术的检测霍乱弧菌的方法。经实验证明，本发明的RPA‑IAC引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且基于该引物并配合扩增内标建立的霍乱弧菌的RPA‑IAC检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检疫具有指导意义。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测霍乱弧菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术

霍乱弧菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，在牡蛎、虾、蟹等贝类及甲壳类水生动物中分布广泛，是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一。人类在自然条件下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或食物经口传染，主要临床表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率高。自从1817年以来，历史上共发生七次霍乱全球大流行的报道，造成数百万人的死亡，故霍乱属于国际检疫传染病，在我国也被列为甲类传染病。我国南方霍乱相对多发，每年需投入大量的人力、物力进行防控，因此对霍乱弧菌的检测在公共卫生上具有十分重要的意义。

目前，对霍乱弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等,而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素，常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度更是进行反复优化，以防止非特异性扩增，在这些条件的制约下选取的引物极易影响扩增的有效性和特异性。此外，荧光检测设备普遍售价偏高，也在一定程度上限制了这类检测方法的推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA-IAC技术的检测霍乱弧菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA引物及内标扩增序列和对应的检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明第一方面提供了引物对和内标扩增序列，所述引物对包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增片段包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测霍乱弧菌的产品中的应用；

在一优选例中，所述制备检测或辅助检测霍乱弧菌的产品包括：制备检测或辅助检测生物样品是否感染霍乱弧菌的产品，以及制备检测或辅助检测病原菌为或候选为霍乱弧菌的产品。

本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对和包含有所述的内标扩增序列的质粒。

在一优选例中，所述的试剂盒还包括RPA恒温扩增试剂。