[发明专利]检测霍乱弧菌的RPA-IAC引物及方法

权利要求书

1.引物对和内标扩增序列，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述内标扩增序列为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物对和内标扩增序列在制备检测或辅助检测霍乱弧菌的产品中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPA恒温扩增试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA恒温扩增试剂为来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmp Basic kits所包含的试剂。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂还包括来自天根生化科技有限公司货号为DP302的细菌基因组DNA提取试剂盒所包含的试剂。

8.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照。

9.权利要求3-8中任一所述的试剂盒在非诊断目的检测或辅助检测霍乱弧菌，或制备检测或辅助检测霍乱弧菌的产品中的应用。

10.一种非诊断目的检测或辅助检测霍乱弧菌的RPA-IAC方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)RPA-IAC扩增：

以生物样品或病原菌含有的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对和包含有权利要求1所述的内标扩增序列的质粒，或利用权利要求3-4中任一项所述试剂盒进行RPA-IAC扩增；

2)根据RPA-IAC扩增的结果判断生物样品是否感染霍乱弧菌，或病原菌是否为或候选为霍乱弧菌；

在步骤1)之前还包括在生物样品或病原菌中提取DNA的步骤；

所述RPA-IAC扩增的结果判断的标准为：

若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物仅有大小为280bp的目标基因片段，或同时拥有大小分别为337bp、280bp的内标扩增片段和目标基因片段，则判定为生物样品感染霍乱弧菌，或病原菌为或候选为霍乱弧菌；若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物只有大小为337bp的内标扩增片段，未含有大小为280bp的目标基因片段，则判定为生物样品未感染霍乱弧菌，或病原菌不为或候选不为霍乱弧菌；若所述RPA-IAC扩增得到的扩增产物未含有大小为337bp的内标扩增片段且未含有大小为280bp的目标基因片段，判定为反应为假阴性，需要重新进行检测；

所述RPA-IAC扩增的反应体系如下：

含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应管；再水化缓冲液：29.5μL；SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的引物各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/L；包含有SEQ ID NO：3所示的内标扩增序列的质粒：1.81×10³copies；模板DNA：50ng；醋酸镁溶液：2.5μL，浓度为280mmol/L；去离子水：补足至50μL；

所述RPA-IAC扩增的反应条件如下：所述RPA-IAC扩增的温度为37℃，时间为40min。