[发明专利]一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株可利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，它是在宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮合酶基因das、二羟基丙酮激酶基因dak。利用本发明的方法构建的重组酿酒酵母在以甲醇为唯一碳源的条件下，菌体细胞量明显增加，且能生成丙酮酸。本发明的方法为利用廉价碳资源生产有机酸的合成的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)，又称α-氧代丙酸，是一种重要的有机小分子，也是一种酸性较弱的有机酸,分子中同时具有羰基和羧基两个官能团,它除具有羧酸和酮的性质外,还具有α-酮酸的性质,是最简单的α-酮酸，属于羰基酸。丙酮酸也是体内产生的三碳酮酸，它是糖酵解途径的最终产物，在细胞浆中还原成乳酸供能，或进入线粒体内氧化生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。因此，丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物。丙酮酸可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化。因此丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用，是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，因分子中包含活化酮和羧基基团，所以作为一种基本化工原料广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域中，可通过化学合成和生物技术多种方法制备。同时有研究已表明，丙酮酸可作为一种抗氧化剂抑制鼠体内氧自由基的氧化作用。

与化学合成法和酶转化法相比,微生物发酵法因原料来源广,能耗低,污染少,成本低而更具有优越性，因而被广泛研究。在丙酮酸生产菌株中，酿酒酵母由于其遗传背景清楚，易操作易调控，培养基要求简单，菌株耐受性好等优点，近年来被广泛用于研究以获得丙酮酸生产菌株。微生物代谢过程中,主要利用糖类积累丙酮酸，但这些糖类物质的成本较高，限制了微生物法制备丁二酸的工业化。因此，若能以廉价的还原性底物为原料，可以在一定程度上降低成本。

甲醇是煤化工产业中的重要产品，近年来，随着甲醇生产工艺的发展，使得甲醇的价格持续走低，因而利用甲醇作为发酵原料成为生物转化过程降低成本的重要突破口。因此，若能通过合成生物学手段，将甲醇代谢模块引入酿酒酵母中，以甲醇作为唯一碳源生产丙酮酸，为利用廉价碳资源生产有机酸的合成的研究奠定了基础。

技术方案

本发明要解决的技术问题是提供一种利用合成生物学方法构建可以利用甲醇作为唯一碳源进行代谢的菌株，并利用该菌株好氧发酵生产丙酮酸，解决了甲醇利用型菌株不能生产有机酸的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，它是在宿主菌种导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak。

其中，甲醇氧化酶aox1将甲醇氧化成甲醛，消耗大量氧气伴随生成过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶cta的催化下转化成氧气和水；甲醛和木酮糖-5磷酸在二羟基丙酮合酶das的催化下转化成二羟基丙酮；随后二羟基丙酮在二羟基丙酮激酶dak的催化下转化成磷酸二羟丙酮，然后进一步代谢成果糖-6-磷酸，进而进入糖酵解途径参与物质循环和有机酸代谢。

其中，所述宿主菌为酿酒酵母，所述酿酒酵母优选酿酒酵母Saccharomycescerevisiae TAM ura3△Pdc^-菌株，该菌株为荷兰Delft大学Antonius J.A.van Maris教授馈赠，以该菌株为出发菌可生产135g/L丙酮酸，发表论文题目为Directed Evolution ofPyruvate Decarboxylase-Negative Saccharomyces cerevisiae,Yielding a C2-Independent,Glucose-Tolerant,and Pyruvate-Hyperproducing Yeast，其具体信息已经在论文中详细公开。