[发明专利]一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，它是在宿主菌中导入甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak；

所述甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的GenBank登记号分别为XM_002494226.1、FJ752551.1、AB472085.1、XM_002493026.1；

其中，所述宿主菌为酿酒酵母。

2.根据权利要求1所述的利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，所述甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的启动子序列分别选自PGK1p、TDH3p、PDC1p、FBA1p中的一种；

甲醇氧化酶基因aox1、二羟基丙酮合酶基因das、过氧化氢酶基因cta、二羟基丙酮激酶基因dak的终止子序列分别选自CYC1t、PGK1t、TDH2t、ENO2t中的一种。

3.权利要求1~2任一所述的利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 构建如下四种表达框：PGK1p- aox1-CYC1t、TDH3p-das- PGK1t、PDC1p-cta-TDH2t、FBA1p-dak-ENO2t，再 使用重叠PCR将上述四种表达框、上游同源臂δ1、下游同源臂δ2、筛选标记基因组合成重组基因片段；

(2) 将步骤（1）得到的重组基因片段转化至宿主细胞，筛选重组菌，得到利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌。

4.权利要求1~2任一所述利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌在发酵产丙酮酸中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，包括以下步骤：

(1a) 试管种子培养：将利用甲醇生产丙酮酸的基因工程菌接种到试管的种子培养基中，30 ℃培养18~22 h；

(2a) 摇瓶种子培养：将试管种子培养基接种到摇瓶的种子培养基中，30 ℃培养22~26h；

(3a) 发酵产丙酮酸：将摇瓶种子培养液进行离心，去除上清种子培养基，并用灭菌水清洗菌体2次，并离心获得菌泥，将菌泥重悬于发酵培养基中，30 ℃培养72~74h。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述种子培养基为YPD培养基，其配方如下：20 g/L葡萄糖,10 g/L酵母粉 20 g/L蛋白胨，溶剂为水。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：5 g/L硫酸铵，3 g/L磷酸二氢钾，0.5 g/L七水硫酸镁，15 mg/L乙二胺四乙酸，4.5 mg/L七水硫酸锌，0.3 mg/L六水氯化钴，1 mg/L四水氯化锰，0.3 mg/L五水硫酸铜，4.5 mg/L二水氯化钙，3mg/L七水硫酸亚铁，0.4 mg/L二水钼酸钠，1 mg/L硼酸，0.1 mg/L碘化钾，0.15 g/L尿嘧啶，10 g/L甲醇，溶剂为水。