[发明专利]基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前国内FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性血清4型FAdV(FAdV-4)在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对FAdV-4血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了禽腺病毒F2基因的原核表达质粒，之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒，检测血清4型禽腺病毒特异性抗体。

实现本发明目的的技术方案是：

本发明所述的一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。

进一步地，所述包被有表达F2蛋白的ELISA酶标板，是通过将纯化的F2基因原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。

本发明所述基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：

(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经0.45um微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；

(2)禽腺病毒基因组的制备：首先将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用；

(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：设计出扩增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物；以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列；

(4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-F2，挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定，鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。

(5)F2原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，并以1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀。图3为本发明SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图，SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物部分在上清中，部分在沉淀中以包涵体的形式存在。之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(如图4所示)。

(6)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:将BL21表达的融合表达产物GST-F2上清经GST标签亲和层析柱纯化后得到纤突蛋白基因F2的表达蛋白。图5为SDS-PAGE分析纯化的F2蛋白表达产物。

(7)检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒：该试剂盒成分包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液(TMB显色液以)及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。