[发明专利]基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，是通过将纯化的F2基因片段原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纤突蛋白基因F2的表达蛋白通过以下步骤得到：

(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；

(2)禽腺病毒基因组的制备：首先将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用；

(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：设计出扩增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物；以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列；

(4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-F2，挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定，鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达；

(5)F2原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，并以1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀；

(6)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:将BL21表达的融合表达产物GST-F2上清经GST标签亲和层析柱纯化后得到纤突蛋白基因F2的表达蛋白。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液是指含0.05%Tween-20的PBST。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液是指TMB显色液。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液是指含0.05％Tween-20的PBST。

8.按照权利要求1～7任一所述的试剂盒在血清4型禽腺病毒检测中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：100稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：100稀释后加入A3、A4孔，剩下的孔用于检测待检样品，1:400稀释，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判为阳性。