[发明专利]机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法

说明书

本发明涉及一种机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法，包括取霉菌孢子液，加入玻璃珠子，进行机械破碎处理，然后进行RNA提取。本发明利用机械法对霉菌孢子壁进行破碎，破碎后结合柱纯化法进行RNA的提取、纯化，再利用试剂盒进行逆转录，而后通过实时荧光定量PCR和凝胶电泳检测提取效果的优劣，并依此建立精准提取霉菌孢子RNA的技术体系。本发明得出的优化后的霉菌孢子RNA提取方法，不仅具有高效的提取效率、操作便捷易控、无毒无害等优点，而且最重要的是提取出的RNA质量良好，满足单细胞后期测序要求，可为今后单孢子测序提供良好的参考价值。

技术领域

本发明涉及一种机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法。

背景技术

虽然关于RNA的提取方法诸多，很多方法也已经日趋成熟，但是对于细胞壁成分复杂的真菌，这些常用核酸提取方法都有局限性，真菌中富含的多糖、色素、核酸酶等物质使得RNA的提取和分离更加困难，特别是像霉菌孢子这类含有较坚硬的孢子壁的RNA提取更受限制。

另一方面，由于单细胞全基因组测序技术的出现，改变了我们传统的大样本细胞测序方式，也由对一个细胞群体的分析转变成了对单个细胞的分析，能够给我们提供更多有价值的研究，如在霉菌培养皿的不同位置，可能由于营养物质、霉菌数量等原因的不同，不同位置霉菌的基因组成不尽相同。与此同时，这也就提高了对少量样本RNA提取的质量与数量的要求。传统方法要求大量样品，使得单细胞测序的方法不能应用在霉菌孢子的研究中。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法。

本发明利用机械法对霉菌孢子壁进行破碎，破碎后结合柱纯化法进行RNA的提取、纯化，再利用试剂盒进行逆转录，而后通过实时荧光定量PCR和凝胶电泳检测提取效果的优劣，并依此建立精准提取霉菌孢子RNA的技术体系。

本发明技术方案如下：

一种机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法，包括：取霉菌孢子液，加入玻璃珠子(以下简称珠子)，进行机械破碎处理，然后进行RNA提取。

如无特殊指明，本发明所述机械破碎主要是指研磨处理。

进一步地，所述霉菌孢子液中孢子数量≥1×10²个/mL。

更进一步地，所述霉菌孢子液中孢子数量≥5×10⁷个/mL。

进一步地，以1mL霉菌孢子液计，机械破碎处理过程中所用玻璃珠子数量为20-40颗，玻璃珠子大小(指直径，下同)为1-3mm，机械破碎处理(研磨)时间为(2×5)min-(4×5)min。

其中，(2×5)min是指机械破碎(研磨)5min后即拿出放置冰上降温至少30s，共进行该操作2次；(4×5)min是指机械破碎(研磨)5min后即拿出放置冰上降温至少30s，共进行该操作4次。

在本发明的一个较佳实施方案中，以1mL霉菌孢子液计，所述霉菌孢子液中孢子数量≥5×10⁷个/mL，玻璃珠子数量为40颗，玻璃珠子大小为1mm，机械破碎处理(研磨)时间为(3×5)min。

在本发明的另一个较佳实施方案中，以1mL霉菌孢子液计，当所述霉菌孢子液中孢子数量不少于1×10²个/mL范围时，玻璃珠子数量为20颗，玻璃珠子大小为1mm，机械破碎处理(研磨)时间为(4×5)min。

具体的，上述机械破碎法提取霉菌孢子RNA的方法包括如下步骤：

(1)取霉菌孢子液，加入玻璃珠子，进行机械破碎(研磨)处理(破壁处理)；

(2)把破壁后的霉菌孢子液转入一个干净的离心管，12,000rpm离心2min，取上清(均质过程)；