[发明专利]用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。本发明提供了制备用于生产葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括如下步骤：向能够产生2,3‑环氧鲨烯的受体菌株中导入葫芦二烯醇合成酶的编码基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌；所述葫芦二烯醇合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5或序列6或序列7。本发明成功运用生物工程技术实现了葫芦二烯醇生物合成途径的异源重建及产物的生产，摇瓶发酵法葫芦二烯醇产量高达82.89mg·L^‑1；同时并通过重组菌株的高密度发酵技术，再提高葫芦二烯醇产量20.48倍。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

葫芦二烯醇(Cucurbitadienol)是从罗汉果、栝楼、西瓜、冬瓜和苦瓜等多种葫芦科植物中分离获得的葫芦烷型四环三萜类化合物的基本前体，其在生物体内能被进一步被酶修饰形成罗汉果甜苷和葫芦素等化合物。其中罗汉果甜苷Ⅴ是罗汉果果实甜味的主要成分，甜度是蔗糖的250倍，是糖尿病患者和肥胖者食品的良好添加剂；另外，葫芦素等苦味成分具有广泛的生物活性，如护肝，抗炎，抗菌，驱虫以及对中枢神经系统和心血管具有保护作用；一些葫芦素还可以作为蜕皮类固醇受体激动剂和拮抗剂。

运用合成生物学策略实现中药有效成分生物合成途径的异源重建及产物的生产，能够积极促进生物合成途径解析和利用，如丹参酮，吗啡和人参皂苷等成分的生物合成途径的研究。在生产方面，Keasling团队耗时10年，将黄花蒿中青蒿酸的合成途径完全解析，并在酿酒酵母中完成了抗疟药物前体—青蒿酸的异源合成工作，青蒿酸的产量达25g·L^-1。

在生物体内2,3-环氧鲨烯能被不同三萜环合酶环合为齐墩果烷型，乌苏烷型，羽扇豆烷型，达玛烷型和葫芦烷型等多种类型三萜母核。其中葫芦二烯醇合成酶(Cucurbitadienol synthase,CBS)能催化2,3-环氧鲨烯生成葫芦二烯醇。目前来源于罗汉果、南瓜、黄瓜和药西瓜等葫芦二烯醇合酶已经被成功克隆。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产葫芦二烯醇的工程菌及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备用于生产葫芦二烯醇的工程菌的方法，包括如下步骤：使能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株表达葫芦二烯醇合成酶，从而获得所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌；所述葫芦二烯醇合成酶的氨基酸序列为序列表中序列5或序列6或序列7。

进一步，所述方法包括如下步骤：向能够产生2,3-环氧鲨烯的受体菌株中导入所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因，得到表达所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因的重组菌，即为所述用于生产葫芦二烯醇的工程菌。

更进一步，所述葫芦二烯醇合成酶的编码基因具体可为如下任一所示DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列4所示的DNA分子；

(5)在严格条件下与(1)-(4)中任一限定的DNA分子杂交且编码序列表中序列5或序列6或序列7所示葫芦二烯醇合成酶的DNA分子；

(6)与(1)-(5)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码序列表中序列5或序列6或序列7所示葫芦二烯醇合成酶的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。