[发明专利]用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用

说明书

本发明公开了用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及应用，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)_k序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。本发明引物池中的引物具有接近的Tm，非特异性扩增比较低，同时易于进一步扩增，可以方便地达到检测目标区域覆盖层数。本发明的方法，可以在同一体系中同时进行上千重PCR，打破了常规多重PCR一般不超过100重的限制。

技术领域

本发明涉及一组用于多重PCR的引物池及其应用，特别涉及用于扩增样品中cfDNA多个目标的NGS建库引物池及其应用。

背景技术

WGS全基因组测序可获得整个基因组的突变、插入、缺失以及拷贝数目等结构变异。然而，由于全基因组数据量巨大，以30X进行测序为例，人类全基因组就会产生超过9OG的测序数据量。而肿瘤等相关的低突变频率，以及插入、缺失、拷贝数等测序，则需要至少5000X层次以上的覆盖度，全基因组测序会产生15T以上的测序数据量。特别是体液标本中肿瘤相关的游离DNA，或者孕妇外周血中源自胎儿的游离DNA含量极低，全基因组的测序量将超过200T。这样大规模的测序数据，显著增加测序的成本，对数据的分析工作造成极大的困难，进而制约测序的应用。因此，在不做任何信号扩增就进行NGS高通量测序，得到的绝大多数信息是正常细胞基因组的信息。在这么强大的背景噪音下，检测的特异性和敏感性就都成问题。不但如此，因为花费大量的人力和财力来做测序得到的99.99％都是无用的信息，相当于高通量地产生垃圾。为解决这个难题，针对高通量测序平台而建立的多重PCR目标区域的捕获与富集技术应运而生。

胎儿或者肿瘤游离DNA的目标区域捕获技术是指通过特定的技术手段，定向捕获目标区域的核酸短片段序列(例如游离DNA片段的长度中位值是165bp)，然后进行建库测序，以达到在对目标区域进行深度测序的目的，同时也使得测序成本与生物信息数据分析成本大大降低。

由于PCR反应很灵敏，PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。这一点在多重PCR中尤为明显，因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标。制约多重PCR技术应用的主要因素包括：非特异扩增和引物二聚体的产生，PCR反应的热力学参数Tm选择，以及如何达到检测目标区域覆盖层数的均衡。将多重PCR的扩增产物应用于高通量测序时，这就带来一个更大的难题：高通量测序研究的疾病基因区域通常是很多而且是不连续的，一般研究区域量在上千个，典型的研究区域量有近6000个，在一些临床检测的应用案例上甚至多达两万个。而现在多重PCR技术都是比较广泛应用于长度较小的目标区域的捕获。超大规格的多重PCR技术非常难以实现。

因此，本领域中需要能有效降低非特异扩增和二聚体产生的应用于NGS建库的多重PCR技术出现，PCR引物池的反应温度Tm要求接近，以及检测目标区域的测序层数要求均匀。

发明内容

本发明的目的在于用于扩增cfDNA样品中多个目标的NGS建库引物池及基于其的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

用于扩增cfDNA样品中多个目标的引物池，引物池中的引物由通用引物段和特异性引物段组成，通用引物段连接在特异性引物的5’端，至少一条引物的通用引物段和特异性引物段之间连接有调整引物Tm的(N)_k序列，各引物的Tm值之间的差值不超过10℃。

作为上述引物池的进一步改进，引物池中引物的结构通式为：

CAPl：通用引物+(N)_k+特异性引物，k为1～15之间的整数；

CAP2：通用引物+特异性引物。