[发明专利]一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法

说明书

本发明涉及一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，属于微生物分离鉴定技术领域。本发明提供的诺丽内生真菌的分离鉴定方法包括以下步骤：1)对诺丽果和叶进行表面消毒；2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25±1℃黑暗条件下培养8～10天；3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。本发明提供的方法能够实现诺丽内生真菌的有效分离和鉴定，利用分离得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，为发掘内生真菌在诺丽中的药效作用奠定基础，亦为抗癌、抗炎药物的研发提供新思路。

技术领域

本发明涉及微生物分离鉴定技术领域，具体涉及一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法。

背景技术

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指那些生活在地上部分且活的植物组织体内，但不引起宿主植物患病的一类有益真菌。因此，植物内生真菌是植物体内微生态系统中的天然组成成分，其长期生活在植物体内这种特殊环境中，不会导致植物患病，反而与宿主植物协同进化，并在演化过程中逐渐形成互惠共生的关系。药用植物内生真菌的次生代谢产物十分丰富，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫、调节免疫及促进植物生长等生物活性，是筛选生物活性成分或先导化合物的有效途径之一，在工业发酵、生物制药、农业生产等领域具有潜在的应用价值。

诺丽(Morinda citrifolia Linn.)是茜草科巴戟天属的植物，在热带地区有着悠久的食用历史，最早可追溯到317世纪晚期。1943年，美国政府将诺丽果认定为可食用植物资源；2003年，欧盟委员会提名诺丽果汁为一种新资源食品；2010年5月，中国卫生部批准诺丽果浆为新资源食品。现代医学和生物学研究证明，诺丽果和果汁对某些疾病具有一定的治疗和辅助治疗作用，如抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化、护肝、抗菌消炎、改善糖尿病、抗血脂、降血压、改善痛风等。近几年来，随着研究的不断深入和新功能的不断发现，诺丽果已经成为世界药用植物和保健饮料的新宠。

诺丽因其卓有特效的抗癌效果而屡遭砍伐及毁灭性利用，加上种群分布的局限性，使得该植物种质资源并不丰富，甚至于处于濒危灭绝的边缘。由于内生真菌具有产生和寄主植物一样的次生代谢产物和活性成分，且分离纯化的内生真菌能通过发酵技术生产相应的活性物质，内生真菌的药用价值已成为国际热点，需最大可能地保留内生真菌不被杀灭。目前内生真菌常采用组织分离法分离，其缺陷有：(1)表面过分消毒，杀死部分内生真菌；(2)表面消毒不充分，表面菌污染；(3)生长快的内生真菌覆盖一些生长缓慢的真菌；(4)所用培养基不能确保所有内生真菌都生长。诺丽内生真菌的药用潜力并没有实现较大程度的挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法。本发明提供的方法能够实现诺丽内生真菌的有效分离和鉴定，为抗癌、抗炎药物研发提供新思路。

本发明提供了一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)对诺丽果和叶进行表面消毒；

2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天；

3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；

4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。

优选的是，所述步骤1)中的诺丽果和叶为八成熟。

优选的是，所述步骤1)的表面消毒包括次氯酸钠溶液消毒和乙醇溶液消毒。

优选的是，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量浓度为2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为75％。

优选的是，次氯酸钠溶液消毒的时间为60～300s，乙醇溶液消毒的时间为30～180s。