[发明专利]一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法

权利要求书

1.一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，由以下步骤组成：

1)对诺丽果和叶进行表面消毒；所述步骤1)的表面消毒包括次氯酸钠溶液消毒和乙醇溶液消毒；所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量浓度为2.6％，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为75％；次氯酸钠溶液+乙醇溶液消毒时间以下述组合进行表面消毒：80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s或300s+180s；所述步骤1)的表面消毒后还包括：采用无菌水对诺丽果和叶清洗2～4次；

2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天；步骤2)得到的诺丽果和叶的边缘部分采用组织印迹法进行无菌检测；

3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；

4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。

2.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中的诺丽果和叶为八成熟。

3.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)得到的诺丽内生真菌后还包括：将诺丽内生真菌在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中进行培养，所述培养条件为25±1℃，20rpm进行液体暗培养。

4.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)的ITS测序鉴定基于核糖体ITS区域的ITS1f和ITS4基因序列。

5.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)的ITS测序鉴定用引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。