[发明专利]一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种含α‑糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示α‑糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。本发明所述生产α‑熊果苷的含α‑糖苷酶基因的重组大肠杆菌，能够在胞内高效合成α‑糖苷酶，以对苯二酚和蔗糖为底物，高效催化对苯二酚的糖基化反应，反应12‑14小时，可得到大于10％的α‑熊果苷溶液，平均生产强度大于8.3g/l·h，且底物对苯二酚的转化率大于90％，α‑熊果苷的产物浓度高，转化率高，有利于α‑熊果苷回收纯化。

(一)技术领域

本发明涉及一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其生产α-熊果苷的应用。

(二)背景技术

熊果苷属于氢醌葡糖苷类化合物，结构式如图1所示，其通过糖苷键将一个D-吡喃葡萄糖与对苯二酚一侧的酚羟基偶联，其化学名为4-羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，是一种高效、安全、绿色、普遍的酪氨酸酶抑制剂，能起到抑制黑色素的形成，是一种广受国内外女性喜爱的化妆品原料，广泛的被化妆品行业使用为皮肤美白添加剂。它同时还具有抗菌、止血、消炎、祛斑、治疗肾脏疾病等作用。

熊果苷分为α-熊果苷和β-熊果苷，它们具有相同的分子组成，二者为差向异构体，都是一种白色的针状晶体，易溶于水、水醇混合物中，微溶于乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂，不溶于石油醚、乙醚等有机溶剂里。相对于其它化学合成的美白化妆品，α-熊果苷主要以生物法合成为主，减少了化学合成引起的污染和分离纯化的成本。同时α-熊果苷作为酪氨酸酶的竞争性抑制剂，其美白活性相对于同类美白化妆品具有更好的疗效。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其制备α-熊果苷的应用，实现了生物法高效生产α-熊果苷。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示α-糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。所述重组大肠杆菌即为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)IFE-amy637，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13992，保藏日期2017年4月7日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

进一步，所述α-糖苷酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明提供一种所述含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌在制备α-熊果苷中的应用。

方法1：所述的应用以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷。所述发酵液中湿菌体含量为5-100g/L(优选20-30g/L)，底物终浓度为5-60g/L发酵液(优选40-60g/L)，所述蔗糖终浓度为300～500g/L发酵液(优选400g/L)。

进一步，所述底物以连续补料形式加入，首次加入300-400g/L发酵液，反应开始后进行底物连续补料，前3h内，以2-3g/L发酵液/30min的速度加入，反应6-9h后，以1.5-2.5g/L发酵液/h的速度加入。

进一步，所述底物补料量为40-60g/L。

方法2：所述的应用以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液离心收集的湿菌体为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，以pH7.0、50mM磷酸缓冲液为反应介质，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷。所述缓冲液中，湿菌体用量为5-100g/L(优选20-30g/L)，底物终浓度为5-60g/L(优选40-60g/L)，蔗糖终浓度为300～500g/L(优选400g/L)。