[发明专利]一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌及其应用

权利要求书

1.一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌在制备α-熊果苷中的应用，其特征在于所述的应用为：以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷；所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示α-糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的；所述蔗糖首次加入300-400 g/L发酵液，反应开始后进行对苯二酚连续分批次补料，前3h内，以2-3 g/L发酵液/30min的速度加入，反应6-9h后，以1.5-3.5 g/L发酵液/h的速度加入。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述发酵液中湿菌体含量为5-100 g/L，对苯二酚终浓度为40-60 g/L发酵液，所述蔗糖终浓度为300-500g/L发酵液。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述对苯二酚补料量为40-60g/L。

4.一种含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌在制备α-熊果苷中的应用，其特征在于所述的应用为：以含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液离心收集的湿菌体为催化剂，以对苯二酚为底物，以蔗糖为辅助底物，以pH7.0、50mM磷酸缓冲液为反应介质，在25-40℃的条件下进行反应，获得含α-熊果苷的反应液，将反应液分离纯化获得α-熊果苷；所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示α-糖苷酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的；所述蔗糖首次加入300-400 g/L发酵液，反应开始后进行对苯二酚连续分批次补料，前3h内，以2-3 g/L发酵液/30min的速度加入，反应6-9h后，以1.5-3.5 g/L发酵液/h的速度加入。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液中，湿菌体用量为5~100 g/L，对苯二酚终浓度为40~60g/L，蔗糖终浓度为300~500g/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：（1）将含α-糖苷酶基因的重组大肠杆菌接种在含50 mg/L卡那霉素的种子培养基中，30-37℃、100-200 rpm培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母粉 5 g/L、蛋白胨 10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9 g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67 g/L、Na₂SO₄ 0.71 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49 g/L，溶剂为去离子水，pH7.0；

（2）发酵培养：将种子液以体积浓度5%的接种量接种到含卡那霉素 50 mg/L的发酵培养基中，在30-37℃培养4-6 h；加入终浓度为5-20g/L的α-乳糖，在22-25^oC继续发酵12-18h，取发酵液离心，收集湿菌体细胞；所述发酵培养基质量终浓度组成：10 g/L蛋白胨、5g/L酵母提取粉、15 g/L 甘油、9 g/L Na₂HPO₄、3.4 g/L KH₂PO₄、3 g/L NH₄Cl、0.71 g/LNa₂SO₄、5g/L MgSO₄，溶剂为去离子水，pH6.5-7.5。