[发明专利]依诺肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种依诺肝素的制备方法。

背景技术

依诺肝素钠（Enoxaparin Sodium）为低分子肝素类（low molecular weight heparin，简称LMWH）品种之一，具有极强的抗凝因子Ⅹa功能及弱的抗凝血酶、与血小板结合及影响血小板功能的作用。用于深静脉血栓的防治，预防血液透析时血栓的形成及DIC的治疗。

依诺肝素是将来自猪肠黏膜的肝素苯甲基酯进行碱性降解而制得的低分子肝素钠盐，主要的制备方法是：肝素钠溶液加入苄索氯铵，得到肝素的季铵盐，真空干燥后的肝素季铵盐在二氯甲烷溶液中与氯化苄酯化，得到肝素苄酯，肝素苄酯在碱性条件下β-消除得到依诺肝素。该方法为法国安万特公司专利方法，但对依诺肝素的纯化脱色精制方法没有提及，因此在国内外关于依诺肝素的制备差别较大，质量也掺次不齐。目前纯化脱色方法主要有活性炭脱色、疏水层析柱、阴离子树脂交换、双氧水氧化脱色，或几种方法的联合使用等。缺点是：活性炭脱色方法脱色效果有限，疏水层析柱和阴离子树脂交换柱操作繁杂，脱色效果差，收率低，且对产品分子量分布造成影响；双氧水氧化虽然脱色效果明显，但对依诺肝素有降解，影响最终产品质量。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种依诺肝素的制备方法，碱解后萃取除杂，然后再进行活性炭脱色，脱色效果好，最终的依诺肝素产品纯度较高，对产品分子量无影响，工艺简便。

技术方案：本发明提供了一种依诺肝素的制备方法，包括下列步骤：（1）成盐：使用肝素钠溶液和苄索氯铵溶液制备肝素季铵盐；（2）酯化：将所述肝素季铵盐溶于二氯甲烷后，加入氯化苄搅拌酯化生成肝素苄酯；（3）碱解：将所述肝素苄酯在碱性条件下进行碱解反应，然后将反应液调至中性后向其中加入盐，搅拌均匀得碱解溶液；（4）萃取：使用1~2倍所述碱解溶液量的疏水有机溶剂对所述碱解溶液进行萃取2~3次，然后过滤取滤液；（5）纯化：向所述滤液中加入3倍甲醇析出沉淀收集得粗品依诺肝素；（6）脱色：将所述粗品依诺肝素溶于水制备成粗品依诺肝素溶液，控制所述粗品依诺肝素溶液的温度在60~80℃、pH为6.0~7.0，向其中加入活性炭对其进行脱色25~40min，过滤除去所述活性炭，降温至室温，加入盐混合均匀，过滤得滤液，向滤液中加入3倍甲醇析出沉淀，抽滤、洗涤、烘干所述沉淀得精品依诺肝素。

优选地，在所述（1）中，所述肝素钠溶液由肝素钠溶于8倍水配制而成，所述苄索氯铵溶液由2~3倍肝素钠重量的苄索氯铵溶于4倍水配制而成。

进一步地，在所述（1）中，先将所述肝素钠溶液缓慢加入到所述苄索氯铵溶液中反应生成粗品肝素季铵盐，然后所述粗品肝素季铵盐再经过2~3次水洗后滤干，50℃下真空干燥15~18h后得所述肝素季铵盐。

优选地，在所述（2）中，所述二氯甲烷的体积与所述肝素季铵盐的重量比为2.5~3.5：1；所述氯化苄的体积与所述肝素季铵盐的质量比为1~2：1。

优选地，在所述（2）中，搅拌酯化的时间为30h，温度为40℃。

优选地，在所述搅拌酯化之后的反应液中还加入1~2倍反应体积的含15%无水乙酸钠的甲醇，抽滤收集沉淀，沉淀再用甲醇抽滤清洗至洗液遇水不变色，将沉淀在50℃下干燥得所述肝素苄酯。

优选地，在所述（3）中，所述碱性条件为0.1N的氢氧化钠水溶液，所述氢氧化钠水溶液的体积与所述肝素苄酯的质量比为20~30：1。

优选地，在所述（3）中，所述盐为氯化钠，所述氯化钠与所述反应液之间的质量体积比为10~20%；和/或，在所述（6）中，所述盐为氯化钠，所述氯化钠与所述粗品依诺肝素溶液之间的质量体积比为10~20%；和/或，在所述（6）中，加入的所述活性炭与所述粗品依诺肝素溶液之间的质量体积比为2~3%。

优选地，在所述（3）中，所述碱解反应的时间为60min，温度为60℃，反应结束后降至室温，用1mol的盐酸将所述反应液调至中性。

优选地，所述疏水有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。