[发明专利]一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用

说明书

本发明公开了一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶‑NADH氧化酶和应用；该制备方法以木质纤维植物中提取的木聚糖为原料，采用耐高温木聚糖酶和α‑葡萄糖醛酸酶酶水解工艺制备葡萄糖醛酸，再通过双功能性糖醛酸脱氢酶‑NADH氧化酶将生成的葡萄糖醛酸氧化制备葡萄糖二酸。本发明制备方法可以有效的节约NAD的使用量，利用NADH氧化酶为糖醛酸脱氢酶原位再生NAD促进辅酶循环，使得糖醛酸脱氢酶不断地催化葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸，从而提高催化效率，转化率可以达100％。同时该制备方法具有高效快速、专一，反应条件温和的优势，整个制备过程中不使用酸碱等化学物质，能耗低，污染小，操作简单易控。

技术领域

本发明涉及食品、医药和化工、清洁生产领域的葡萄糖二酸，具体地涉及一种葡萄糖二酸的酶法制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用。

背景技术

葡萄糖二酸是一种葡萄糖衍生物，可作为原料制备多种聚合物和生物质新能源，在化工领域具有广泛的应用价值，被认为是“最具价值的生物炼制产品”之一。例如，可作为合成聚酰胺类、羟基化的尼龙(PHPAs)及聚二甲基硅氧烷(BDMS)聚酰胺等聚合物的基本单体，合成无毒、可生物降解材料，用于家用洗涤剂、防腐剂和混凝土外加剂等。葡萄糖二酸也具有调控体内激素、提高机体免疫功能、减少癌症病发的作用，它在食品和医药领域的关注度和市场需求逐年增加。因此，葡萄糖二酸作为最具价值的生物炼制产品成为食品工业研究开发的热点之一。葡萄糖酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸残基广泛分布于葡萄糖醛酸木聚糖(硬木)、阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖(软木、禾本科植物：秸秆)等半纤维素中，半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类可再生资源，含量占木质纤维生物量的20-35％。我国是农业大国，每年秸秆产量不低于10亿吨，占世界秸秆总产量的25％-30％，若仅烧以作肥料，既浪费资源又造成环境污染。因此，利用这些生物废料制备低聚木糖具有一定的经济效益和社会效益。

由葡萄糖制备葡萄糖二酸是将其末端的羰基和伯羟基氧化为羧基，而其它的4个仲羟基不被氧化。葡萄糖醛酸及葡萄糖二酸生产方法包括：化学法、微生物发酵法和酶法等。现有的葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的共催化氧化方法。李建新等公开了有机电化学合成技术领域的一种葡萄糖酸及葡萄糖二酸的制备方法(CN103436910A)。这些化学法制备葡萄糖二酸存在试剂耗费量大，污染环境等问题；而具有反应条件温和且环境污染少的微生物发酵法或酶法作为化学替代法越来越受到研究者的重视，作为微生物发酵法，现有技术有，如Prather等分别从Saccharomyces cerevisiae和小鼠体内提取肌醇-1-磷酸合成酶(Inol)和肌醇氧化酶(MIOX)用于生产葡萄糖醛酸，将Pseudomonas syringae醛酸脱氢酶(Udh)等关键酶克隆到E.coli中，完成从D-葡萄糖生成D-葡萄糖二酸的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology，2009，75：589-595；Metabolic Engineering，2010，12：298-305)。王淼等(CN105802896A)发明了利用能产葡萄糖二酸-1,4-内酯的葡糖醋杆菌将葡萄糖或淀粉质食品原料水解的可发酵性糖类为底物发酵生产葡萄糖二酸-1,4-内酯的方法；小西一诚等提供了具有显著改善的葡萄糖二酸的合成能力的转化体和用该转化体有效生产葡萄糖二酸的方法(CN104080918B)康振等通过在大肠杆菌中表达来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)的肌醇加氧酶(MIOX)，将肌醇转化为葡萄糖醛酸，再通过表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，将生成的葡萄糖醛酸转化为葡萄糖二酸(CN104312987A)；通过在酵母中表达肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，实现葡萄糖醛酸的生成途径(CN104312935A)，同时表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了葡萄糖二酸的合成途径(葡萄糖二酸产量60mg/L)(CN104312935A)。通过将肌醇加氧酶(MIOX)及醛酸脱氢酶(Udh)融合，采用直接融合及添加不同连接肽的方式，克隆表达至酵母菌株中，强化了葡萄糖二酸的合成途径。通过定点突变获得酶活提升的肌醇加氧酶突变体，并将其与醛酸脱氢酶(udh)在酵母中共表达，强化了葡萄糖二酸合成途径(CN104911117A)。但利用发酵法生产葡萄糖二酸存在产量低(6.02g/L)、培养时间长(2天)等问题都抑制了此方法的发展，而且在分离提取方法上还没有研究(化工进展，2011,33(11)：2502-2508)。相比微生物发酵法，酶法具有直接作用底物且反应速度更快、生产周期短等优势，作为酶法的现有技术有，如Marsh等以小鼠腺体的葡糖醛酸酶为催化剂，在H₂O₂和Fe²⁺存在条件下转化葡萄糖醛酸产生葡萄糖二酸(Carbohydrate Research，1986，153：119-131)；专利W002/074926利用己糖氧化酶、醛氧化酶、醛脱氢酶作用于D-葡萄糖而将其转化D-葡萄糖二酸，日本国专利第3713530号利用葡萄糖氧化酶作用于D-葡萄糖的方法。但是仍未能很好解决转化时间长，酶反应性低，成本高等问题。