[发明专利]一种葡萄糖二酸的制备方法及其制备中的糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶和应用

权利要求书

1.一种葡萄糖二酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从木质纤维植物中提取的木聚糖为原料；

(2)将步骤(1)制备的木聚糖加入到耐高温木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶混合酶液中，进行水解反应，水解结束后加入乙醇进行沉淀除杂，然后取上清液经浓缩即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步骤(2)制备的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶混合反应液进行酶氧化反应；

(4)氧化反应结束后，反应液经弱碱性环氧树脂吸附分离后即可得葡萄糖二酸；

所述耐高温木聚糖酶为来源于海栖热袍菌Thermotiga maritima的GH10木聚糖酶基因(TmXynB)；所述α-葡萄糖醛酸酶为来源于海栖热袍菌T.maritima的GH67α-葡萄糖醛酸酶基因(TmAguA)；所述糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶由嗜热双孢菌Thermobispora bispora嗜热双孢菌糖醛酸脱氢酶(TbUDH)基因通过Linker连接着海栖热袍菌Thermotiga maritima NADH氧化酶(TmNOX)基因组成并经密码子优化获得，所述糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述木质纤维植物为硬木、软木或禾本科植物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述木聚糖与混合酶液的木聚糖浓度为10-100mg/mL，混合酶液pH为4.0-7.5；酶液中耐高温木聚糖酶活性为1-20U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性为0.2-5.0U/mL。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水解反应温度60℃～90℃，时间40min～10h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合反应液中葡萄糖醛酸浓度为0.16～10.0mg/mL；反应液pH为6.0-8.2，反应液中糖醛酸脱氢酶活性为0.1-5U/mL，NADH氧化酶活性为0.1-5U/mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合反应液中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度为0.2-2.0mM。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酶氧化反应温度30℃～65℃，时间40min～2.0h。

8.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶的基因的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一种权利要求1所述的制备方法中所使用的双功能性糖醛酸脱氢酶-NADH氧化酶在氧化葡萄糖醛酸生成葡萄糖二酸中的应用。