[发明专利]一种外酶C3转移酶基因治疗药物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因治疗药物技术领域，具体地，涉及一种外酶C3转移酶基因治疗药物及其制备方法和应用。

背景技术

青光眼是一种以眼压升高为主要危险因素，以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡为病理基础的视神经病变。传统的青光眼治疗方法主要是降低眼压，但临床实践证明，仅用降眼压方法不足以治疗该病。一些青光眼患者经药物或手术治疗控制眼压后，其视野损害仍在进一步加重。而正常眼压性青光眼眼压虽在相对正常范围，但视功能却仍然进行性受损，表明降眼压固然重要，但不能完全中断青光眼性视神经损害的病理进程，如RGC凋亡和神经纤维丢失。因此，降眼压联合干预RGC凋亡(即神经保护)的方法才是治疗青光眼的理想途径。

Rho GTP酶(Rho GTPases，Rho)是GTP结合蛋白，单体分子量为20-30kDa，属于Ras超家族成员，作为分子开关(molecular switch)参与多项细胞活动的调节，如细胞骨架、细胞粘连、分泌内吞、细胞周期及细胞凋亡等。近年来，有研究显示Rho通路在调节NMDA介导的神经兴奋性毒性中有重要作用。在大鼠海马神经元中RhoA调节NMDA受体的功能；并且NMDA引起Ca²⁺内流能激活Rho的活性，进一步激活p38α引发神经元凋亡。同时有报道显示Rho下游分子ROCK的抑制剂H-1152P和Rho激酶抑制剂fasudil分别在视神经挤压损伤(optic nerve crush)模型和兴奋性毒性损伤模型中能促进RGC的存活，具有神经保护作用。因此，抑制Rho及其下游分子ROCK可成为青光眼治疗中神经保护的重要途径。外酶C3转移酶(Exoenzyme C3 Transferase，C3)是从肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)中分离出来的特异性Rho抑制剂。其抑制机理是使Rho核糖基化而失去功能。据文献报道，在视神经挤压损伤动物模型中经C3处理后，可增加RGC的存活和轴突的再生。然而，关于C3在青光眼性视神经损伤中的保护作用国内外罕有文献报道。

实验结果证实C3能有效的保护RGC，减轻由NMDA引起的神经毒性，具有神经保护作用。但由于C3蛋白作为外源性蛋白，易被眼内水解酶降解，其作用仅能维持3天。如需反复玻璃体注射给药则失去临床实用意义。

因此，如果能开发一种同时兼顾视神经保护和降眼压药物，将会对青光眼预防与治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供了一种外酶C3转移酶(Exoenzyme C3Transferase，C3)基因治疗药物及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

发明人课题组前期研究结果显示C3转移酶基因能显著影响人小梁网细胞的肌动蛋白纤维、细胞骨架和细胞粘附，增加房水流出，从而起到降眼压的作用；C3转移酶基因序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种外酶C3转移酶基因治疗药物，包括C3基因通过与病毒载体构建重组载体，所述重组载体通过病毒包装获得C3转移酶基因治疗药物。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体(Lentivirus，LV)或者腺相关病毒载体Adeno-associated virus(AAV)。

更优选地，所述慢病毒载体为LV病毒载体pLvx-MCMV-ZsGreen。

外酶C3转移酶基因在制备眼部神经保护药物或者降眼压药物中的应用。

外酶C3转移酶基因在制备青光眼预防药物或治疗药物中的应用。

一种外酶C3转移酶基因治疗药物制备方法，包括以下步骤：

S1.根据C3基因序列设计扩增引物，并且在上下游引物分别引入合适的酶切位点；

S2.使用上述步骤设计的引物，PCR扩增目的基因；

S3.目的基因与病毒质粒构建重组质粒；

S4.阳性重组质粒筛选验证；

S5.阳性重组质粒进行病毒包装，获得外酶C3转移酶基因治疗药物。

优选地，所述上游引物引入的酶切位点为EcoR I；所述下游引物引入酶切位点为BamH I。

优选地，所述扩增引物为：

上游引物：5'-CGGAATTCATGGCTTATTCCATTAATCAAAAGGC-3'；

下游引物：5'-CGGGATCCTTATTTAGGATTGATAGCTGTGC-3'。