[发明专利]一种用于染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种适于少量样本的用于染色体异常检测的测序用文库构建方法及试剂盒。

背景技术

染色体是细胞核中的遗传物质，人类有23对染色体，其中22对为常染色体，1对为性染色体。染色体异常包括染色体结构异常和数目异常，由染色体异常导致的疾病，临床上表现为染色体病，在自发性流产、死胎、早夭中占50％以上，新生儿中发病率约1％，属于常见的出生缺陷。

染色体数目异常指多1条或数条染色体、多1条或数条染色体片段，常见的染色体数目异常为13三体、18三体及21三体。在产前诊断中，染色体异常的主要检测技术包括：核型分析、比较基因组杂交技术(arrayCGH)、荧光原位杂交技术，但是由于羊水或脐带血中胎儿遗传物质较少，需要对遗传物质进行放大。如对于核型分析来说，该方法需经过细胞培养富集胎儿细胞，非常耗时耗力，病人等待报告的周期长。

近年来，随着下一代高通量测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术的迅速发展，由于其存在分辨率高，通量大等优势，目前已经被广泛应用于染色体异常的分析。通过传统的建库方法能够检测染色体异常，还可发现新变异，但该方法通常要求较高的DNA样本起始量(100ng以上)，当采集样本数量有限并无法获得足量DNA时(如临床采集又不经实验再放大的羊水、脐血等样本)，通过现有的建库方法往往不能得到满足后续测序需求的文库产量。若可以实现不经细胞培养，而是直接利用羊水、脐血等少量样本进行建库并检测染色体异常，能够大大节约实验时间和检测成本，将会有很广阔的应用前景。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够适用于羊水等少量样本的用于染色体异常检测的测序用文库的构建方法及试剂盒。

本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过优化反应体系及反应条件，实现构建适用于羊水少量样本的、染色体异常检测的测序用文库，从而完成了本发明。

即，本发明包括：

1.一种用于染色体异常检测的文库构建方法，该方法包括：

步骤A：提取样本gDNA，获得gDNA；

步骤B：将所述gDNA进行酶切处理，纯化，获得酶切产物；

步骤C：将所述酶切产物进行末端修复，纯化，得到平末端DNA片段；

步骤D：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；

步骤E：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，纯化，得到加接头的DNA片段；

步骤F：将所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，纯化，得到扩增产物；

其中，步骤B中所述的酶切处理使用的酶为dsDNA Fragmentase；

步骤C中所述末端修复使用试剂包括：1μL T4DNA聚合酶，1μL T4多聚核苷酸激酶、5μL 10×多聚核苷酸激酶缓冲液及1μL dNTP；

步骤D中所述3'端加A使用试剂包括：0.5μL Klenow片段(3'-5'exo-)、2.5μL dATP及2.5μL 10×缓冲液；

步骤F中所述PCR扩增的扩增引物包括：

Ann引物序列(SEQ ID NO:1)：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3'

Index引物序列(SEQ ID NO:2)：

5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATANNNNNNNGTGACTGGAGTTC-3'；

其中，N为随机碱基。

2.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤A中样本为羊水、脐血、全血、组织中任意一种。

3.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤B中gDNA的量为8～15ng。

4.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤B的酶切处理的条件为37℃50分钟。

5.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤C的末端修复的条件为20℃30分钟。

6.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤D的3'端加A的反应条件为37℃30分钟。

7.根据项1所述的文库构建方法，其中，所述步骤F的PCR扩增条件为94℃预变性2分钟、(94℃变性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)17个循环、72℃延伸10分钟、4℃保存。

8.一种用于染色体异常检测的文库构建试剂盒，其用于实施项1～7中任一项所述的文库构建方法，其包括：