[发明专利]一种赭曲霉素A的无酶免疫传感器的制备及其检测方法

说明书

本发明涉及一种赭曲霉素A（OTA）的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明在玻碳电极表面层层组装石墨烯和聚乙二醇，构筑高密度OTA抗原传感界面，合成金纳米粒子并制备金纳米粒子探针，采用间接竞争免疫分析原理，包被OTA抗原和OTA目标抗原竞争OTA抗体形成免疫复合物，将金纳米粒子探针与免疫复合物进行反应，电极表面键合的金纳米粒子氧化生成AuCl₄^‑，通过电化学测定AuCl₄^‑还原峰峰电流值的大小达到检测OTA的目的。本发明有利于高灵敏在线检测OTA，样品不必提纯处理，简单快速，检测体系无需酶的使用，降低了检测成本。

技术领域

本发明涉及一种赭曲霉素A的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素（Ochratoxins，OTs）是对人类健康威胁最大的霉菌毒素之一。赭曲霉毒素包含有赭曲霉毒素 A（OTA）、赭曲霉毒素 B（OTB）、赭曲霉毒素 C （OTC）等 7 种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素 A（OTA）毒性最大，在农作物中分布最广泛，对人畜的影响最大。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究机构（IARC）于 1993 年将 OTA 列为可能引起人类癌症的物质即ⅡB 类致癌物。OTA 的毒性作用主要表现为肾脏毒性、肝脏毒性、遗传毒性、致畸性、致癌性、致突变作用、神经毒性和免疫毒性。世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（JECFA）和联合国粮食及农业组织于 1991 年拟定了 OTA 每人每周最大允许摄入量为 112 ng/kg（按 体重计），最小有毒剂量为每日 8 μg/kg，在随后的会议当中，又将每周最大允 许摄入量降低到 100 ng/kg。此外，许多相关国际组织和机构都制定了不同的限量标准，对OTA 的在粮食作物中的污染进行监测和控制，以保证食品安全。此外，许多相关国际组织和机构都制定了不同的限量标准，对 OTA 在食品和粮食作物中的污染进行监测和控制，以保证食品安全。因此，OTA的鉴定和定量检测在环境分析中具有重要的意义。

目前粮食作物中的OTA的检测技术大多采用基于实验室分析的高效液相色谱、液相色谱-质谱及气象色谱-质谱联机检测方法，样品前处理过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用高。

本发明将具有优良性能的石墨烯和聚乙二醇用于OTA的电化学免疫传感器的制备，并针对OTA高灵敏定量检测的需求，引入金纳米粒子的信号放大功能，构建超灵敏的OTA的电化学免疫分析方法，实现了OTA的无酶检测，降低了成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的OTA检测方法的灵敏度低、检出限高和成本高的问题，提供一种OTA的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，实现OTA的高灵敏、低成本而在线检测。

本发明的技术方案：一种OTA的无酶免疫传感器的制备及其检测方法，包括石墨烯修饰电极的制备，聚乙二醇的修饰，包被OTA抗原的修饰，金纳米粒子探针的制备，抗体和样品混合液的温育，抗体浓度的优化，金纳米粒子探针和免疫复合物的反应，电化学检测方法的构建，电化学检测条件的优化，标准曲线的绘制，实际样品的检测；

（1）石墨烯修饰电极的制备：

a、0.5 mg 石墨烯分散在 1 mL 乙醇中，超声10分钟，得到0.5 mg/mL 石墨烯分散液；

b、在直径为3 mm玻碳电极表面修饰5 mL 0.5 mg mL^-1石墨烯分散液，放入干燥器干燥处理。

（2）聚乙二醇的修饰：

在步骤（1）制备的石墨烯修饰电极表面滴涂5 μL 2 mg/mL 聚乙二醇分散液，用于固定OTA，清洗晾干，保存于4 ^oC备用。

（3）包被OTA抗原的修饰：