[发明专利]一种赭曲霉素A的无酶免疫传感器的制备及其检测方法

权利要求书

1.一种赭曲霉素A（OTA）的无酶免疫传感器的制备方法，其特征在于包括石墨烯修饰电极的制备，聚乙二醇的修饰，包被OTA抗原的修饰；具体制备方法如下：

（1）石墨烯修饰电极的制备：

a、0.5 mg 石墨烯分散在 1 mL 乙醇中，超声10分钟，得到0.5 mg/mL 石墨烯分散液；

b、在直径为3 mm玻碳电极表面修饰5μL 0.5 mg mL^-1石墨烯分散液，放入干燥器干燥处理；

（2）聚乙二醇的修饰：

在石墨烯修饰电极表面滴涂5 μL 2 mg/mL 聚乙二醇，用于固定OTA，清洗晾干，保存于4 ^oC备用；

（3）包被OTA抗原的修饰：

在工作电极表面滴加10 μL 300 μg/L OTA抗原，湿盒温育1小时后，用0.01 M pH 7.4（0.05% Tween-20）磷酸缓冲溶液（PBST）淋洗修饰电极，滴涂10 μL 5% 牛血清蛋白，封闭电极上的非特异性活性位点，保存于4 ^oC备用。

2.利用权利要求1制得的OTA无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于包括金纳米粒子探针的制备，抗体和样品溶液的温育，抗体浓度的优化，金纳米粒子探针和免疫复合物的反应，电化学检测方法的构建，检测条件的优化，标准曲线的绘制，实际样品的检测。

3.根据权利要求2构建的OTA无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于金纳米粒子探针的制备：

a、将50 mL 0.01%氯金酸加热至沸，剧烈搅拌下向其中迅速加入1.75 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续反应10 min，即可得到粒径13 nm 金纳米粒子溶液；

b、取权利要求6步骤a得到的金纳米粒子溶液用0.1 M K₂CO₃调至pH 9.0后，加入25 μL1 mg/mL羊抗鼠抗体，于室温搅拌2 h；

c、将上述混合液用0.01 M (pH 7.4) 磷酸缓冲溶液离心洗涤三次；随后沉淀物用含1%牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液分散，即得所需金纳米粒子标记羊抗鼠抗体（金纳米粒子探针），保存于4 ^oC备用。

4.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于OTA抗体和样品的温育：

5μL不同浓度的OTA标准溶液或样品与5 μL 稀释一定倍数OTA抗体混合制备温育液；将温育液滴到OTA免疫传感器表面，将其置于25 ^oC 温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

5.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于OTA抗体的优化：

对OTA抗体的浓度进行优化，采用稀释100倍数的OTA抗体为最佳抗体浓度。

6.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于金纳米粒子探针和免疫复合物的反应：

将10μL的金纳米粒子探针滴涂到根据权利要求7 制备的修饰电极表面，将其置于25 ^oC湿盒中温育1 h，小心地用0.01 M pH 7.4 PBST冲洗，保存于4 ^oC备用。

7.根据权利要求2构建的OTA的无酶免疫传感器检测OTA的方法，其特征在于电化学检测方法的构建：

电化学检测OTA体系采用经典三电极工作体系：工作电极、参比电极和对电极，工作电极为根据权利要求9制备的修饰电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极，测定液为2 mL 0.1 M HCl溶液；对电化学检测时的氧化电位和氧化时间进行优化，1.40 V为最佳氧化电位，30 s为最佳氧化时间。