[发明专利]一种基于乙酰胆碱酯酶信号放大原理检测双酚A的方法

权利要求书

1.一种基于乙酰胆碱酯酶信号放大原理检测双酚A的方法，其特征在于，包括操作：

通过在Fe₃O₄磁纳米粒子上修饰1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，制备活化后的Fe₃O₄磁纳米粒子，再与DNA1偶联，制备Fe₃O₄-DNA1悬液；

在金纳米粒子上修饰适配体DNA1的互补链DNA2及乙酰胆碱酯酶，形成DNA2-AuNPs-AchE聚合物并分散于磷酸缓冲液中；

Fe₃O₄-DNA1悬液、待测试样、DNA2-AuNPs-AchE聚合物溶液混合，用磁铁分离，磁铁吸附的样品重悬于pH 6.0的乙酰胆碱溶液中，水解后用pH计或pH试纸进行检测；

其中，所述Fe₃O₄磁纳米粒子的粒径为50～200nm，Fe₃O₄磁纳米粒子经SiO₂包覆、氨基化后与过量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺在室温下孵育20～40min，然后通过磁分离去除残留的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，取DNA1与活化的磁纳米粒子反应5～8h，然后重悬于超纯水中储存在2～6℃下备用；所述的氨基化的操作为：Fe₃O₄磁纳米粒子经SiO₂包覆后，加入硅酸四乙酯，搅拌10～20h后，用乙醇和水洗涤、干燥，干燥后的磁纳米粒子、与3-氨丙基-3-乙氧基硅烷混合，所述Fe₃O₄磁纳米粒子和3-氨丙基-3-乙氧基硅烷的接入比例为0.1～0.5g：5mL；加入无水乙醇，在50～70℃下反应5～8h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fe₃O₄磁纳米粒子通过水热法合成，具体为：六水合三氯化铁和乙酸钠溶于乙二醇，然后加入少量聚乙二醇，搅拌后转移至水热反应釜中，在200～230℃下反应10～15h,反应完成后将得到的产物用无水乙醇洗3～8次，置于室温下干燥；

其中，六水合三氯化铁、乙酸钠、乙二醇、聚乙二醇的质量比为2：3～6：50～80：1～2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SiO₂包覆的操作为：Fe₃O₄磁纳米粒子溶于0.05～0.2M盐酸，超声5～15min，再用去离子水洗涤，磁铁分离去上清液，将Fe₃O₄均匀分散在溶液中，所述溶液由乙醇2～6体积份和超纯水1体积份组成，并加入质量浓度20～35％的氨水，

其中，Fe₃O₄磁纳米粒子、氨水的质量比为0.3：2～5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金纳米粒子的粒径在10～20纳米，修饰DNA2及乙酰胆碱酯酶(AchE)的方法为：金纳米粒子与10μM的DNA2混合反应20～30h，离心分离除去未反应的试剂，弃上清，重悬于pH 7～8的缓冲液中，得DNA2-AuNPs偶联物；加入AchE到偶联物溶液中使得AchE的终浓度为100μg/mL，在室温下孵育60min，轻微振荡以形成DNA2-AuNPs-AchE聚合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述金纳米粒子通过以下方法制备：超纯水和质量浓度为0.2～0.5％的氯金酸溶液混合，加热至沸腾，7-8min后加入质量浓度为0.5～2％柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌10～20min；

其中，超纯水、氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液的体积比为90～100：1～5：2。