[发明专利]一种筛选I型鸭肝炎病毒3C蛋白抑制剂的试剂盒

说明书

本发明涉及一种可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白的制备方法及其应用，具体制备方法如下：将SEQ ID NO.3所示第3～574位核苷酸连接于pET‑32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌BL21为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为0.2～1.4mmol/L、温度为16～37℃条件下诱导表达2～12小时，表达获得可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白，本发明的方法蛋白为可溶性表达，获得的蛋白是天然的，不需要使用变性剂进行变性、复性获得有活性的蛋白，可用于3C蛋白酶活性检测，还可以用于3C蛋白酶抑制剂筛选，对I型鸭肝炎病毒的抗病毒药物研发和筛选具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白的制备方法，还涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白的应用。

背景技术

我国是世界上养鸭数量最多的国家，鸭的饲养量约占世界的70％，养鸭业在我国农业经济中占有重要地位，因此鸭源微生物的研究具有重要的社会和经济意义。鸭病毒性肝炎是鸭甲型病毒性肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的一种急性、高致死性传染性，该病发病急、病程短、传播快、病死率高，主要侵害3周龄以内的雏鸭，是一种严重威胁养鸭业的病毒性传染病。

鸭甲型肝炎病毒属于微RNA病毒科禽肝炎病毒属。3C蛋白是微RNA病毒科重要的蛋白酶之一，负责多聚蛋白水解为成熟具有功能的单个蛋白，参与了病毒的复制和病毒粒子的组装过程。由于3C蛋白序列的高保守性，所以单一抑制3C蛋白的药物能对不同属微RNA病毒的该酶均有良好抑制作用，如鼻病毒3C蛋白酶抑制剂芦平曲韦AG7088对肠病毒71型、B3型柯萨奇病毒和脊髓灰质炎病毒也有作用，因此3C蛋白成为广谱抗小RNA病毒药物的重要研究靶点。

目前临床上并无有效治疗DHAV的药物，发病后只能以高免血清和卵黄抗体进行治疗。研究和开发一种对DHAV有良好治疗效果的抗病毒药物，具有重要的临床意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白的制备方法，本发明的目的之二在于提供由前述所述制备方法制得的可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白；本发明的目的之三在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白在制备筛选I型鸭肝炎病毒3C蛋白抑制剂中的应用；本发明的目的之四在于提供一种筛选I型鸭肝炎病毒3C蛋白抑制剂的试剂盒；本发明的目的之五在于提供利用所述的试剂盒筛选I型鸭肝炎病毒3C蛋白抑制剂的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白的制备方法，将SEQ ID NO.3所示第3～574位核苷酸连接于pET-32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌BL21为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为0.2～1.4mmol/L、温度为16～37℃条件下诱导表达2～12小时，表达获得可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白。

优选的，所述诱导表达为在IPTG终浓度为1.0mmol/L、温度为16℃条件下诱导表达10小时。

本发明中，诱导表达后还包括纯化步骤，具体如下：收集菌液，在12000r/min条件下离心10min后收集菌体，收集的菌体用平衡缓冲液悬浮，然后在冰浴下超声，将破碎后的菌体在4℃、12000r/min条件下离心10min，收集上清，上清用Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，得纯化的可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白；所述平衡缓冲液各组分浓度如下：50mM NaH₂PO₄·2H₂O，300mM NaCl。

更优选的，所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次之间间隔30sec。

2、由所述制备方法制得的可溶性I型鸭肝炎病毒3C蛋白。