[发明专利]一种分子标签及其试剂和应用

说明书

本发明公开一种分子标签，其全长序列为5'‑NNNNNNNNNTGACT‑3'，是由9个随机碱基N组成的标签编码部分和5个碱基组成的起界限作用的固定序列两部分组成，该全长序列的两侧为黏性末端，3'端有由固定序列突出的胸腺T碱基，5'端含有一个磷酸化基团。本发明的分子标签只具有标签功能，能够兼容所有的二代测序技术和已有测序平台；该分子标签没有索引，制备方便，成本低，只需合成随机碱基功能模块；该分子标签在使用时无需改动任何原高通量测序实验流程，不会和原有高通量测序索引冲突；应用本发明的分子标签的样本可以和普通样本混合测序而互不影响。本发明还公开了含有该分子标签的试剂、该分子标签的使用方法及数据分析方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兼容所有二代测序等高通量测序技术的分子标签的试剂及其应用方法。

背景技术

二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术在基因检测中得到广泛运用，是精准医疗时代的主流技术。高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)，是相对于传统的桑格测序(Sanger Sequencing)而言的。NGS 技术通量高、价格低，对百分之一频率以上基因变异的检测非常精准。但是，NGS技术对于超低频变异检测的效果不佳，究其原因在于NGS技术本身会引入一些错误(背景噪音)，这些错误发生的频率等于甚至大于微量基因变异的超低频率，我们无法分区出真实的基因变异。

液体活检技术是目前精准医疗领域热门之一；相比传统的组织活检，液体活检具有微创、易重复、时效性高的特点。液体活检应用前景广阔，包括个体化用药、肿瘤检测、疾病分型、早期筛查等。液体活检的检测对象包括三类：循环肿瘤细胞(CTC)、外泌体(Exosome) 和循环肿瘤DNA(ctDNA)。其中，循环肿瘤细胞难获取，外泌体成分不易分离。ctDNA是目前最易获取且成分单一的活检对象。生物体细胞凋亡后，裂解的DNA进入血液中形成细胞循环DNA(cfDNA)；肿瘤细胞凋亡裂解进入到血液的DNA形成就是循环肿瘤DNA(ctDNA)。细胞循环DNA中，ctDNA含量极低，百分之一、千分之一甚至更低。ctDNA的频率已经达到乃至低于NGS背景噪音水平，常规的测序操作无法满足ctDNA变异检测的需求。虽然，通过增大测序深度可以在一定程度上提高ctDNA的检测准确性，但更深测序意味着更高的测序成本，而且也无法消除PCR过程产生的扩增错误。

为了克服NGS的背景噪音，诞生了分子标签技术(一组随机碱基)。分析NGS技术过程，我们发现噪音主要来自扩增和测序；如果我们给所有原始ctDNA引入一个唯一编码标签(Barcode)，通过Barcode来区分哪些是PCR扩增引入的分子序列，哪些是样本中原始的分子序列，这样就可以还原真实变异。分子标签技术的要点是为每一条原始DNA分子添加唯一编码(Barcode)，待测序完成后，结果数据中相同编码的片段表示来源于同一条原始DNA分子，这些片段分为一组，只有那些组内共享的变异才是真实的变异。

目前实现分子标签技术的方案主要有两类。

第一类主要是针对life公司的测序仪。它是将分子标签连接到扩增引物上，通过扩增将标签添加到目的片段中。这种方法适用于采用多重扩增技术富集目的产物的方法，不兼容捕获富集方案。此外，引入标签的扩增过程本身也会引入错误。

第二类主要针对的是illumina公司测序仪。它是对二代测序接头进行改造，目前常见有两种思路，一种是替换索引序列，另一种是接在测序引物之后。