[发明专利]一种分子标签及其试剂和应用

权利要求书

1.一种兼容所有高通量测序方法及测序平台的分子标签，其特征在于，所述分子标签的全长序列为5'-NNNNNNNNNTGACT-3'，是由9个随机碱基N组成的标签编码部分和5个碱基组成的起界限作用的固定序列两部分组成；所述全长序列的两侧为黏性末端，3'端有由固定序列突出的胸腺T碱基，5'端含有一个磷酸化基团；所述随机碱基N选自A、T、C、G。

2.一种分子标签试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的分子标签和溶剂。

3.如权利要求2所述的分子标签试剂，其特征在于，所述溶剂为双蒸馏水，分子标签浓度为50μM。

4.如权利要求1所述分子标签用于高通量测序的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：

步骤1、将分子标签连接到样品DNA两端；

步骤2、进行高通量测序建库操作；

步骤3、连接测序接头、扩增、进行高通量测序。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤1的具体操作为：

1.1准备样品DNA；如果样品DNA过长，需要将DNA片段化，一般用超声打断，如果样品DNA是ctDNA，无须再超声打断；

1.2将样品DNA进行末端修复补平；

1.3将样品DNA进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化，使3'端突出一个腺嘌呤A碱基；

1.4使用磁珠法对步骤1.3的产物进行纯化，只保留样品DNA，可防止残留的磷酸基团使分子标签产生平末端自连现象；

1.5使用T4连接酶将本发明的分子标签连接到步骤1.4处理完成的样本DNA两端，所形成的新片段的两端为分子标签，中间为原始样品DNA。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：

2.1使用磁珠法纯化步骤1得到的产物；

2.2将纯化后的产物进行标准的高通量测序建库操作。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：

3.1将步骤2所得产物进行5'端磷酸化和3'端腺苷酸化；

3.2使用T4连接酶连接测序接头到步骤3.1产物的两端；

3.3使用接头引物对连接产物进行聚合酶链式反应，获取扩增产物；

3.4将扩增产物进行高通量测序。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

步骤4、高通量测序之后的数据分析，分析方法如下：

4.1将原始数据进行过滤质控；

4.2提取分子标签序列并通过检测标签数据有效性进一步过滤质量不高的测序数据；

4.3将新的测序结果数据进行基因组比对；

4.4根据标签编码将基因组定位相同的比对结果序列进行分组；

4.5以组为单位，检查比对结果序列，仅将组内共享的变异保留下来；

4.6对校验后的结果序列进行变异分析；

4.7对变异结果进一步解读分析。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤4.2中提取标签的方法是：

只保留固定序列的位置和碱基组成都正确的reads；截取固定系列及之前的随机标签序列；将随机标签序列加到fastq格式的信息行中；将新的fastq信息行、截短的reads组成新的fastq文件；成对reads都必须通过检验，否则都去除。